酵母双杂交系统筛选与禽流感病毒NS1相互作用的宿主因子

论文摘要

禽流感病毒非结构蛋白1（NS1蛋白）全长约为230个氨基酸,理论分子量约为26KDa,主要包括两个功能结构域,即N-末端的RNA结合结构域和和C-末端的效应结构域。NS1蛋白是一个多功能的病毒蛋白,它不仅影响着该病毒其他基因的表达,更能通过与宿主多种细胞因子的相互作用干预宿主细胞的正常功能,抵抗宿主的抗病毒系统。NS1蛋白因此被认为是禽流感病毒的一个重要毒力因子。为了寻找与NS1相互作用的其它宿主蛋白以及试图探索NS1的新功能,最终阐明禽流感的致病性机制,我们利用酵母双杂交系统,以NS1为诱饵蛋白,从人胸腺cDNA文库中筛到了8个宿主因子可与NS1蛋白相互作用,我们选择U蛋白作为我们研究的目的蛋白,并作了点对点酵母双杂交回转实验。结果发现两者确实是互作的,并且互作的部位位于NS1蛋白的RNA结合结构域上。同时我们利用GST Pull-down进一步验证了二者的相互作用。在研究当中还发现,高致病性禽流感病毒H5N1亚型NS1蛋白的80-84位氨基酸缺失可能对禽流感的致病性很重要,这提示针对H5N1型高致病性禽流感病毒可能是一个新的药物靶点。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 1 研究的目的和意义
• 2 主要研究内容
• 3 研究技术路线
• 第一章 论文综述
• 1.1 禽流感病毒研究进展
• 1.1.1 禽流感病毒的形态和化学成分
• 1.1.2 禽流感病毒的分子结构与分类
• 1.1.3 禽流感病毒的复制与致病机理
• 1.1.4 存在问题与展望
• 1.2 NS1蛋白的结构
• 1.2.1 N-末端RNA结合区的结构
• 1.2.2 C-末端效应区的结构
• 1.3 NS1蛋白的功能
• 1.3.1 抑制和利用宿主细胞的转录翻译系统
• 1.3.2 拮抗干扰素的抗病毒作用
• 1.3.3 NS1蛋白下调细胞凋亡
• 1.4 NS1蛋白与其他宿主蛋白相互作用
• 1.4.1 NS1蛋白和importina/β相互作用
• 1.4.2 NS1蛋白和nucleolin相互作用
• 1.5 酵母双杂交系统
• 1.5.1 酵母双杂交系统的作用原理
• 1.5.2 酵母双杂交系统选用酵母作为报告株的优点
• 1.5.3 酵母双杂交系统相对其他方法具有的优点
• 1.5.4 酵母双杂交系统中常见的问题
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株及细胞系
• 2.1.2 质粒载体
• 2.1.3 引物
• 2.1.4 酶类、分子量标准与试剂盒
• 2.1.5 主要化学试剂及常规溶液的配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 PCR扩增
• 2.2.2 DNA片段的回收（DNA片段凝胶回收试剂盒）
• 2.2.3 限制性内切酶酶切反应
• 2.2.4 酶切DNA片段与酶切载体的连接
• 2.2.5 感受态细胞的制备（RbCI法）
• 2.2.6 RbC1感受态细胞的转化
• 2.2.7 质粒快速抽提（质粒小量纯化试剂盒）
• 2.2.8 酵母感受态的制备与转化
• 2.2.9 酵母蛋白的提取
• 2.2.10 酵母质粒的提取
• 2.2.11 酵母转化子β-半乳糖苷酶的固体测活
• 2.2.12 细胞培养及转染
• 2.2.13 Western Blotting
• 2.2.14 融合蛋白的原核表达与纯化
• 2.2.15 GST Pull Down分析
• 第三章 实验结果
• 3.1 pGBKT7-NS1重组质粒的构建
• 3.1.1 PCR扩增禽流感病毒NS1基因
• 3.1.2 pGBKT7-NS1酵母表达载体的构建
• 3.2 酵母双杂交系统筛选与NS1相互作用的宿主蛋白
• 3.2.1 pGBKT7-NS1在酵母AH109中蛋白表达的检测
• 3.2.2 pGBKT7-NS1自激活活性的检测
• 3.2.3 cDNA文库转化酵母AH109
• 3.2.4 阳性克隆的筛选
• 3.2.5 提取酵母质粒进行PCR扩增并转化大肠杆菌
• 3.2.6 测序结果与分析
• 3.2.7 回交验证
• 3.3 GST Pull-down验证NS1蛋白与文库蛋白的相互作用
• 3.3.1 PCR扩增文库蛋白基因
• 3.3.2 pGEX4T1-U原核表达载体的构建
• 3.3.3 U蛋白在原核细胞中的表达
• 3.3.4 GST Pull-down实验
• 第四章 讨论
• 4.1 酵母双杂交系统
• 4.2 蛋白相互作用的鉴定
• 4.3 NS1蛋白功能提示
• 参考文献
• 硕士期间发表文章
• 致谢
• 附录