论文摘要
猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）是近年来新发现畜禽类病毒之一，疑为一种潜在人兽共患病病原。根据猪圆环病毒的致病性及基因组特征，可分为无致病性Ⅰ型（PCV1）和有致病性Ⅱ型（PCV2）。其中PCV2是断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原体。它与许多猪相关疾病的发生有关，如猪皮炎与肾炎综合征（PDNS）、增生性坏死性肺炎（PNP）、猪呼吸道综合征（PRDC）、繁殖障碍、先天性颤抖、肠炎等疾病，并且这些相关联猪的疾病，已在全世界范围内发生和流行，死亡率10％～30％不等。较严重的地区，猪场在暴发断奶仔猪多系统衰竭综合征时，死淘率高达40％左右，其危害和造成的重大经济损失显而易见，现已被世界各国的兽医与养猪业者公认为是继猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）之后新发现的重要的猪传染病，目前还没有有效的预防和治疗措施。因此，如何防制该病和尽早检测该病已成为养猪生产面临的新问题。传统的检测方法（电镜法、免疫荧光技术、原位杂交法、免疫组化法、聚合酶链式反应等）多适用于实验室检测，无法应用于实践或进行大面积的血清学调查。因此，建立一种快速、敏感、特异的检测方法对猪场进行清群，建立健康猪群，有着重要的意义。猪圆环病毒属于圆环病毒科圆环病毒属，无囊膜，二十面体对称，核酸为共价闭合、环状、单股DNA病毒。研究表明，PCV1和PCV2均含有两个主要的开放阅读框，即ORF1和ORF2。其中ORF1编码病毒的复制相关蛋白（Rep蛋白），是PCV1、PCV2产生抗原交叉性的主要蛋白质。ORF2编码病毒的主要结构蛋白（Cap蛋白），是PCV1、PCV2的主要保护性抗原，在PCV1与PCV2间不发生交叉反应，只有PCV2 ORF2蛋白可以被PCV2多抗识别。本研究利用PCV2吉林株（JL01）作为免疫原，PCV2 ORF2原核表达蛋白作为间接ELISA包被抗原，进行PCV2特异性单克隆抗体的筛选和制备，为建立准确快速的鉴别PCV1和PCV2的诊断方法奠定基础。首先采用PK-15细胞对PCV2吉林株（JL01）培养，收获的细胞培养物反复冻融3次，经PCR鉴定和蔗1密度梯度离心提纯后，作为免疫原；根据GenBank中发表的PCV2ORF2基因序列，设计合成一对特异性引物，采用PCR方法从收获的病毒液中，扩增出大小为579bp的核苷酸片段，并克隆到表达载体pET-32a中，经限制性内切酶酶切和PCR鉴定，得到阳性重组表达质粒pET-32a-ORF2。将其转化到表达宿主菌BL21中，经IPTG诱导，成功表达了ORF2基因编码的部分结构蛋白，经SDS-PAGE分析，表达特异带约为40KD。Western-Blot印迹表明，表达的重组蛋白能够被PCV2阳性血清所识别。由此说明，重组表达蛋白具有良好的反应原性，可以作为间接ELISA包被抗原，进行PCV2ORF2抗体的筛选。与此同时，将免疫原与等量佐剂混合后，采取常规免疫与体外脾脏加强免疫结合的方式免疫BALB／c小鼠。将纯化、变性、复性等处理后的重组蛋白作为包被抗原，建立间接ELISA诊断方法。按常规方法取免疫鼠脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞进行融合和克隆，经间接ELISA筛选，成功获得2株抗PCV2 ORF2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为C4D2和E3D4，其细胞培养上清效价分别为1∶1 024、1∶512，小鼠腹水效价分别为1∶204 800、1∶102 400。单克隆抗体特异性结果显示，C4D2和E3D4仅与融合表达的PCV2 ORF2蛋白和PCV2吉林株反应，而与PCV1、猪细小病毒（PPV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）不反应，说明此2株单克隆抗体特异性好。2株单克隆抗体的获得，为建立准确快速的鉴别PCV1和PCV2的诊断方法提供了有力的手段。