香蕉胚性悬浮细胞超低温保存及遗传转化的研究

论文摘要

本研究在前人工作的基础上,以贡蕉（Musa AA Pisang Mas cv.Mas）品种为试材,对其再生体系、超低温保存和遗传转化进行了比较深入的研究。其主要试验结果如下:1、以贡蕉（Musa AA Pisang Mas cv.Mas）的未成熟雄花序为外植体,分别利用不同浓度的2,4-D和Picloram诱导胚性愈伤组织,发现4 mg/L的Picloram诱导效果最好,比同浓度的2,4-D诱导的胚性愈伤组织率高出一倍以上。但是Picloram诱导的胚性愈伤组织由于含水量较高难于建立悬浮系,而用2,4-D诱导的胚性愈伤组织比较容易建立悬浮系。比较了不同浓度的ABA对体细胞胚诱导、成熟和萌发的影响,其中0.5 mg/L的ABA能够促进体细胞胚的成熟、萌发和植株再生,其成熟体胚数量为37600个/mL PCV,其处理的体胚萌发率和植株转换率分别为30.73%、23.42%。2、建立了贡蕉悬浮细胞的玻璃化法保存技术体系。具体方法为:取处于悬浮培养对数期的胚性细胞,在含有0.5 mol/L蔗糖的培养液中预培养2 d,在室温下用装载液（ML+2 mol/L甘油+0.4 mol/L蔗糖）处理40 min,在0℃用玻璃化液PVS2处理30 min,迅速投入液氮,保存24 h后,37℃水浴解冻,用含有1.2 mol/L蔗糖的洗涤液洗涤3次,每次10 min,TTC法检测细胞生活力最高可达80.46%。将细胞转移到含有0.5 mol/L的过渡培养基上,24 h后转移到恢复培养基中,对悬浮细胞进行再培养,通过体细胞胚胎发生途径获得了再生植株。3、应用透射电镜对香蕉胚性悬浮细胞玻璃化法超低温保存过程中细胞超微结构变化进行了观察。发现细胞在经过预培养、装载、脱水的过程中,细胞质壁分离程度逐渐加重,液泡体积变小,部分细胞器逐渐膨大。在液氮中保存后,部分细胞的细胞壁、细胞核以及细胞器受到了严重的损伤,是导致细胞致死的可能原因之一。部分细胞结构完整,虽然细胞结构发生了变化,但是程度不深,在恢复培养时会自动修复,可以再生出植株。4、用含质粒载体pCAMBIA1301的根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105对贡蕉悬浮细胞进行了转化,通过测定GUS基因瞬时表达率,对转化初期的主要影响因素进行了研究。结果表明,取处于对数期的悬浮细胞和浓度为OD6000.2菌液混合,在室温、8 000r/min离心5 min,然后在110 rpm的旋转摇床上摇5 min,在体胚诱导和成熟培养基上共培养8 d,瞬时表达率达到最高值25.3%。通过对体细胞胚的进一步选择和再培养,得到了转基因抗性芽。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 香蕉生物技术研究进展
• 1.1 香蕉离体培养研究进展
• 1.1.1 器官发生途径
• 1.1.2 体细胞胚发生途径
• 1.2 香蕉遗传转化研究进展
• 1.2.1 香蕉转基因受体系统的建立
• 1.2.2 香蕉遗传转化系统
• 2 植物种质超低温保存研究进展
• 2.1 超低温保存技术优点
• 2.2 超低温保存技术原理
• 2.3 影响超低温保存的主要因素
• 2.3.1 材料的选择
• 2.3.2 预处理
• 2.3.3 冰冻保护剂
• 2.3.4 冰冻方法
• 2.3.5 化冻
• 2.3.6 化冻后处理
• 2.3.7 生活力测定
• 2.4 超低温保存后细胞的超微结构观察
• 3 本研究的目的与意义
• 第二章 香蕉体细胞胚胎发生途径植株再生体系的优化研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 外植体的选择与处理
• 1.2.2 愈伤组织的诱导,胚性愈伤组织的选择和继代培养
• 1.2.3 悬浮培养
• 1.2.4 体细胞胚的诱导和成熟
• 1.2.5 植株再生
• 1.2.6 培养条件
• 2 结果与分析
• 2.1 不同植物生长调节剂2,4-D和Picloram诱导愈伤组织的效果比较
• 2.1.1 2,4-D诱导愈伤组织的效果
• 2.1.2 Picloram诱导愈伤组织的效果
• 2.2 ABA对香蕉体细胞胚诱导、萌发和再生的影响
• 2.2.1 ABA对体细胞胚诱导的影响
• 2.2.2 ABA对体细胞胚萌发和再生的影响
• 3 讨论
• 3.1 2,4-D和Picloram对香蕉愈伤组织诱导的影响
• 3.2 ABA对香蕉体细胞胚发生的影响
• 第三章 贡蕉胚性细胞悬浮系超低温保存的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 贡蕉胚性细胞悬浮系的建立和继代培养
• 1.2.2 玻璃化超低温保存
• 1.2.3 超微结构观察的样品处理
• 1.2.4 数据统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 香蕉胚性悬浮细胞玻璃化超低温保存技术体系的建立
• 2.1.1 利用正交设计方法优化超低温保存技术体系
• 2.1.2 单因子试验
• 2.2 香蕉胚性细胞玻璃化法超低温保存过程中细胞超微结构的变化
• 2.2.1 正常生长的胚性悬浮细胞（对照）的超微结构特点
• 2.2.2 经过预培养2d后的细胞超微结构的变化
• 2.2.3 经过装载液处理后的细胞结构特点
• 2处理后的细胞结构特点'>2.2.4 经过PVS₂处理后的细胞结构特点
• 2.2.5 在液氮中保存24h后迅速解冻的细胞结构特点
• 2.2.6 恢复生长7d的细胞超微结构
• 3 讨论
• 3.1 胚性细胞玻璃化法超低温保存
• 3.2 超低温保存过程中胚性悬浮细胞的超微结构变化
• 第四章 香蕉胚性悬浮细胞遗传转化体系研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 根癌农杆菌菌株与质粒
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 抗生素、AS及GUS检测液配方
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 选择培养中Hyg选择压的确定
• 1.2.2 转化程序
• 1.2.3 转化因子的筛选
• 1.2.4 GUS报告基因的检测
• 2 结果与分析
• 2.1 选择培养中Hyg选择压的确定
• 2.2 转化因子的筛选
• 2.2.1 菌液浓度对根癌农杆菌转化的影响
• 2.2.2 共培养时间对根癌农杆菌转化的影响
• 2.2.3 侵染时间对根癌农杆菌转化的影响
• 2.2.4 不同侵染方式对根癌农杆菌转化的影响
• 2.3 转化体的筛选及转化植株的获得
• 3 讨论
• 3.1 酚类物质对农杆菌感染香蕉悬浮细胞的影响
• 3.2 农杆菌菌液对香蕉胚性细胞瞬时表达率的影响
• 3.3 共培养时间对香蕉胚性细胞瞬时表达率的影响
• 3.4 不同侵染方式对香蕉胚性细胞瞬时表达率的影响
• 第五章 总结
• 1 结论
• 2 进一步研究的内容
• 参考文献
• 附录（图版与说明）
• 缩略词表
• 致谢
• 作者简历