CD73在肿瘤血管新生中的作用

论文摘要

CD73又称为胞外-5′-核苷酸酶（Ecto-5′-Nucleotidase,EC3.1.3.5,ecto-5′-NT）,通过糖基-磷脂酰肌醇（glycosyl phosphatidylinositol,GPI）锚定于细胞膜外表面。近年研究表明:发生转移的乳腺癌、结肠癌等恶性肿瘤组织CD73活性显著升高。血管新生是肿瘤转移复发的必要条件之一。我们的研究表明:CD73+/+小鼠乳腺癌新生血管明显多于CD73-/-小鼠;抑制CD73活性可降低裸鼠乳腺癌血管新生。提示CD73在肿瘤血管新生过程中可能发挥重要作用。但CD73如何发挥作用目前国内外尚无报道。本课题拟利用CD73+/+、CD73-/-两种基因型小鼠,进行肺微血管内皮细胞原代培养及建立荷瘤小鼠模型。通过血管形成、蛋白组学等方法研究CD73对肿瘤血管新生的影响,筛选出CD73可调控的血管新生相关蛋白,从而深入探讨CD73与肿瘤血行转移的关系,为遏制肿瘤的血管新生提供新靶点。本研究主要分为四部分,第一部分在基因和蛋白两个水平鉴定CD73敲基因小鼠（品系,C57BL/6）的基因型:基因组PCR鉴定,CD73+/+型小鼠显示为CD73基因的188bp条带,而CD73+/+型小鼠显示为替换基因Neo的280bp条带;CD73酶组织化学染色鉴定,在CD73+/+型小鼠肝、心、肾组织染色阳性,可见大量棕黄色反应物;而CD73-/-型小鼠的组织染色阴性。第二部分CD73敲基因小鼠(CD73-/-)和野生(CD73+/+)小鼠肺微血管内皮细胞的原代培养及鉴定,两种基因型肺微血管内皮细胞的黏附力、运动力、管腔形成能力实验。原代培养的CD73+/+和CD73-/-型小鼠肺微血管内皮细胞的生物学行为差异明显。CD73-/-型小鼠内皮细胞与基质成分之一胶原Ⅳ的黏附力增强,但CD73+/+型小鼠的内皮细胞迁移力要强于CD73-/-型小鼠。为模拟肿瘤环境,在培养的内皮细胞中加入肿瘤细胞条件培养基,结果发现CD73+/+型小鼠内皮细胞的运动力增强更加明显。提示CD73促进内皮细胞的运动,尤其在肿瘤环境下。因为内皮细胞的运动是新生血管形成的关键步骤,我们认为CD73可以促进血管新生。管腔形成实验显示CD73+/+型小鼠血管内皮细胞在Matrigel上管腔形成数量多且管腔较完整。在加入肿瘤上清后管腔形成早于未加上清组,这一现象在CD73+/+型更为明显。提示CD73有利于促进体外培养的血管内皮细胞形成新的管腔,在肿瘤环境中这种作用进一步增强。第三部分利用CD73+/-、CD73-/-两种基因型小鼠建立肿瘤模型在体观察CD73+/+、CD73-/-两种基因型荷瘤小鼠肿瘤血管新生的差异:两种基因型小鼠移植小鼠乳腺癌和前列腺癌细胞后肿瘤组织中血管新生能力存在差异。在CD73+/+型小鼠两种肿瘤组织早期（2周）血管新生能力强于CD73-/-型小鼠;肿瘤生长2周至4周左右,CD73+/+型小鼠的瘤组织体积明显大于CD73-/-型小鼠,而在晚期（5周）肿瘤组织内血管新生、瘤组织大小和重量两组均无差别,提示CD73可能与肿瘤早期的血管新生相关。第四部分应用蛋白组学技术,在血管内皮细胞中寻找与CD73表达相关的蛋白,以探讨CD73在血管新生中的作用机制:在CD73+/+型小鼠的血管内皮细胞中β-actin表达明显高于CD73-/-型小鼠。β-actin是细胞内的骨架蛋白之一,参与多种细胞的运动,这一发现解释了CD73+/+型内皮细胞的运动力及管腔形成能力强于CD73-/-型的现象。内皮细胞的蛋白组学研究尚发现有其他未知蛋白发生变化,这些蛋白可能与CD73的表达相关。综上所述,我们认为:CD73分子在调控血管内皮细胞的生物学行为方面发挥重要作用;在肿瘤生长早期CD73能促进肿瘤血管新生,从而有利于肿瘤的生长和血行转移;其作用机制与CD73调控β-actin有关。本研究为肿瘤的早期治疗提供了新的思路。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 CD73敲基因小鼠的鉴定
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 小鼠肺微血管内皮细胞原代培养及生物学行为的初步探讨
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• -/-型和CD73^+/+型荷瘤小鼠肿瘤血管新生的研究'>第三部分 CD73^-/-型和CD73^+/+型荷瘤小鼠肿瘤血管新生的研究
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第四部分 应用蛋白组学技术探讨CD73基因敲除对血管新生相关蛋白的影响
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 结论
• 致谢
• 附录
• 综述 CD73（Ecto-5'-Nucleotidase）在疾病中的作用及意义
• 参考文献