玉米促分裂原活化蛋白激酶C族MAPKK基因ZmMKK4的分离及功能分析

论文摘要

非生物胁迫是影响植物生长发育和产量的重要环境因素,而其中又以干旱、低温和盐渍的影响最为严重。植物在长期的进化过程中形成了一套主动的防御机制,能够识别逆境信息并通过信号传递最终调节植物的生长发育,从而抵御不良环境的影响。大量研究表明,在逆境条件下植物体内积累渗透调节物质如脯氨酸、可溶性糖、甜菜碱等,同时,许多基因被诱导表达。植物体内存在复杂的信号传递途径,蛋白质的可逆磷酸化反应对于信号的快速、精确传递起着重要作用。其中蛋白质的磷酸化是由蛋白激酶催化完成。MAPK级联途径是存在于真核生物中进化上保守的信号通路,在细胞信号的转换和放大过程中起重要作用。MAPK级联途径由三个成员组成,分别是MAPK、MAPKK及MAPKKK,此三个信号组分按照MAPKKK-MAPKK-MAPK的方式依次磷酸化,将外源信号级联放大向下传递。基因的数量显示MAPKK位于MAPK级联途径的关键环节,MAPKKs通过整合不同MAPKKKs接受的多种信号,并将这些信号传递给下游MAPKs。到目前为止,不同的研究鉴定了多种植物中的MAPKKs,但在玉米中仅分离到ZmMEK1和ZmMAPKK1。早期的研究发现,ZmMEK1与玉米根尖的增殖有关,另外,该激酶也能够被NaCl轻微的诱导。关于ZmMAPKK1的功能的研究还未见报道。本研究从玉米品种郑单958根系中分离到一个C组MAPKK基因,命名为ZmMKK4,对其序列特征、表达模式,以及过表达转基因拟南芥和烟草的抗逆生理功能做了初步研究。主要结果如下:（1）从玉米分离到促分裂原蛋白激酶激酶ZmMKK4,该基因开放阅读框编码一个357个氨基酸的蛋白,蛋白序列分析发现该蛋白具有进化上保守的11个蛋白激酶催化结构域,并且在N端有一个保守的MAPK的锚定位点。进化树分析表明,ZmMKK4属于C族的MAPKK。（2）构建pBI121-ZmMKK4-GFP表达载体,并在洋葱表皮细胞中瞬时表达。在荧光显微镜下观察到细胞核内有GFP激发的绿色荧光,说明ZmMKK4定位于细胞核。（3）Northern杂交结果表明,ZmMKK4在玉米根、茎、叶中均有表达,在叶中表达量最高。低温、NaCl处理和外施H2O2均能诱导ZmMKK4的表达,而外施ABA抑制ZmMKK4的表达,表明ZmMKK4可能参与调控高盐和低温胁迫,而H2O2信号介导了这一过程。（4）构建pBI-ZmMKK4正义表达载体,成功转化拟南芥和烟草。RT-PCR和Westernblot结果均表明,ZmMKK4已经在转基因植株中稳定表达。（5）高盐处理条件下,过量表达ZmMKK4基因的转基因拟南芥种子比野生型拟南芥种子萌发率高,转基因拟南芥幼苗的生长比野生型拟南芥幼苗好。（6）低温处理条件下,过量表达ZmMKK4基因的转基因拟南芥幼苗比野生型拟南芥幼苗的叶绿素含量高,转基因拟南芥植株比野生型拟南芥植株的存活率高。（7）干旱胁迫处理下,过表达ZmMKK4的转基因烟草的抗氧化能力得到改善。转基因烟草比野生型烟草细胞内源H2O2积累量少,氧化胁迫较轻。（8）低温、高盐和干旱条件下,转基因植株相容性物质脯氨酸、可溶性糖的积累,以及抗氧化酶的活性明显高于野生型植株。（9）高盐和低温胁迫下,过表达ZmMKK4的转基因拟南芥增强了内源AtMPK4的活性。（10）低温、高盐和干旱条件下,过表达ZmMKK4的转基因植株增强了胁迫相关基因的表达。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 植物MAPK级联途经
• 1.1.1 植物中的MAPKKKs
• 1.1.2 植物中的MAPKKs
• 1.1.3 植物中的MAPKs
• 1.2 MAPK级联途径参与植物生理响应的研究
• 1.2.1 MAPK级联途径参与调控生物胁迫
• 1.2.1.1 AtMPK3、AtMPK6 和AtMPK4 参与抗病反应
• 1.2.1.2 SA诱导蛋白激酶与伤诱导蛋白激酶参与调控植物的抗病反应
• 1.2.1.3 AtMPK3 参与调控农杆菌侵染
• 1.2.1.4 ROS与MAPKs在植物病原信号传递中的关系
• 1.2.2 MAPK级联途径参与调控非生物胁迫
• 1.2.3 MAPK级联途径参与植物激素信号转导
• 1.2.3.1 MAPK级联途径参与调控乙烯信号转导
• 1.2.3.2 MAPK级联途径参与调控ABA信号转导
• 1.2.3.3 MAPK级联途径参与调控生长素信号转导
• 1.2.4 MAPK级联途径参与生长发育调控
• 1.2.4.1 MAPK级联途径参与调控气孔发育
• 1.2.4.2 MAPK级联途径参与调控胞质分裂
• 1.2.4.3 MAPK级联途径参与调控植物衰老
• 1.3 MAPK信号的特异性
• 1.3.1 支架蛋白
• 1.3.2 MAPK组分的亚细胞定位
• 1.3.3 蛋白磷酸酶的调控作用
• 1.4 本研究的目的及意义
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 植物材料培养与处理
• 2.1.3 菌株与质粒
• 2.1.4 PCR引物
• 2.1.5 酶与各种生化试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 植物基因组DNA提取
• 2.2.1.1 CTAB法
• 2.2.1.2 SDS法
• 2.2.2 植物材料总RNA的提取
• 2.2.3 反转录cDNA第一链的合成
• 2.2.4 PCR扩增
• 2.2.5 连接反应
• 2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.7 大肠杆菌感受态细胞的转化
• 2.2.8 碱法小量质粒 DNA 的提取
• 2.2.9 DNA序列测定
• 2.2.10 Northern杂交分析
• 2.2.10.1 总RNA的提取
• 2.2.10.2 甲醛变性胶电泳
• 2.2.10.3 转膜
• 2.2.10.4 预杂交
• 2.2.10.5 探针的制备
• 2.2.10.6 杂交
• 2.2.10.7 洗膜
• 2.2.10.8 放射自显影
• 2.2.11 Western blot检测蛋白表达
• 2.2.11.1 蛋白质提取及含量测定
• 2.2.11.2 SDS-PAGE
• 2.2.11.3 转膜
• 2.2.11.4 Western blot
• 2.2.12 凝胶内激酶实验
• 2.2.12.1 蛋白质提取及含量测定
• 2.2.12.2 凝胶内激酶实验
• 2.2.13 洋葱表皮亚细胞定位
• 2.2.13.1 pBI121- ZmMKK4-GFP表达载体的构建
• 2.2.13.2 pBI121-ZmMKK4-GFP重组蛋白亚细胞定位
• 2.2.14 根癌农杆菌介导的转化
• 2.2.14.1 表达载体的构建
• 2.2.14.2 农杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.14.3 冻融法转化农杆菌
• 2.2.15 拟南芥的无土栽培、转化及分析
• 2.2.15.1 无土栽培
• 2.2.15.2 从培养皿中移栽拟南芥
• 2.2.15.3 拟南芥转化
• 2.2.15.4 转基因拟南芥鉴定
• 2.2.16 农杆菌介导的烟草转化
• 2.2.17 转基因烟草植株的PCR检测
• 2.2.18 转基因植株生理指标测定
• 2.2.18.1 叶绿素含量的测定
• 2.2.18.2 抗氧化酶活性测定
• 2.2.18.3 游离脯氨酸含量测定
• 2.2.18.4 可溶性糖含量测定
• 2O₂含量测定'>2.2.18.5 H₂O₂含量测定
• 2.2.18.6 DAB和NBT染色
• 3 结果与分析
• 3.1 玉米促分裂原活化蛋白激酶激酶ZmMKK4 基因的分离
• 3.2 ZmMKK4 基因的序列分析
• 3.2.1 ZmMKK4 全长cDNA分析
• 3.2.2 ZmMKK4 编码蛋白质序列分析
• 3.2.3 ZmMKK4 序列系统发生分析
• 3.3 ZmMKK4 的亚细胞定位
• 3.4 ZmMKK4 在玉米中的表达分析
• 3.4.1 ZmMKK4 在玉米不同部位的表达分析
• 3.4.2 ZmMKK4 在不同信号物质和逆境胁迫下的表达分析
• 3.5 ZmMKK4 基因在拟南芥中的转化
• 3.5.1 转基因表达载体的构建
• 3.5.2 转基因拟南芥的鉴定
• 3.6 过表达ZmMKK4 增强转基因拟南芥对高盐胁迫的抗性
• 3.6.1 过表达ZmMKK4 增强转基因拟南芥在高盐条件下的种子萌发率
• 3.6.2 过表达ZmMKK4 增强转基因拟南芥幼苗对高盐胁迫的抗性
• 3.7 过表达ZmMKK4 提高了转基因拟南芥的抗低温能力
• 3.7.1 过表达ZmMKK4 提高了转基因拟南芥幼苗的抗冷能力
• 3.7.2 过表达ZmMKK4 提高了转基因拟南芥植株的抗冻能力
• 3.8 过表达ZmMKK4 提高转基因拟南芥抗盐和抗冷胁迫的分析
• 3.8.1 过表达ZmMKK4 提高了高盐和低温胁迫下转基因拟南芥的Pro及可溶性糖含量
• 3.8.2 过表达ZmMKK4 提高了高盐和低温胁迫下转基因拟南芥的POD、CAT的活性
• 3.8.3 过表达ZmMKK4 增强了高盐和低温胁迫下转基因拟南芥中AtMPK4 的活性
• 3.8.4 过表达ZmMKK4 增强了高盐和低温诱导的相关基因的表达
• 3.9 ZmMKK4 基因在烟草中的转化
• 3.9.1 转基因表达载体的构建
• 3.9.2 转基因烟草的鉴定
• 3.10 过表达ZmMKK4 提高了转基因烟草的抗旱能力
• 3.11 过表达ZmMKK4 提高转基因烟草抗旱性的分析
• 3.11.1 过表达ZmMKK4 增强了干旱胁迫诱导的相关基因的表达
• 3.11.2 过表达ZmMKK4 增强了转基因烟草的抗氧化能力
• 3.11.3 过表达ZmMKK4 提高转基因烟草脯氨酸含量
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况