海参肠中溶菌酶分离纯化的工艺研究

论文摘要

溶菌酶，又称细胞壁水解酶，专门作用于细菌细胞壁的骨架物质-肽聚糖，广泛存在于高等动植物组织及分泌物、原生动物、昆虫和各种微生物中。溶菌酶本身是一种蛋白质，安全性能高，在食品、医药、生物学中得到了广泛的应用。商品溶菌酶多由蛋清中提取，仅对革兰氏阳性菌有作用，限制了其应用范围，近年来国内外对多种来源的溶菌酶进行了广泛的研究，但有关海洋生物溶菌酶的研究报道较少。本文对一种新型海洋生物溶菌酶的分离纯化及理化性质进行了研究，为海洋生物溶菌酶的进一步研究和应用奠定了基础。本研究从海参肠中分离纯化溶菌酶，并测定其酶学性质及抑菌作用。首先在4℃下将海参湿肠打浆，用Tris-HCl缓冲液抽提得到含有溶菌酶的上清液。上清液经浊点萃取法（CPE）浓缩、透析、阳离子交换柱（CM52纤维素）层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析分步纯化，最后得到电泳纯的溶菌酶制剂。实验结果表明，海参肠溶菌酶经CM52纤维素阳离子交换柱层析纯化效果最为明显，纯度提高了11.3倍，去除了大部分杂蛋白。经Sephadex G-75凝胶过滤层析柱层析纯化海参肠溶菌酶纯度提高到18.7倍。最终溶菌酶经纯化比活达到3026.1U/mg，纯度提高了18.7倍，活力回收为46.0%。最后对纯化的溶菌酶性质研究表明，该酶分子量约为16kD，对溶壁微球菌的最适作用温度为35℃，最适作用pH为6.5，在45℃以下和pH4.0～8.0之间都有较好的稳定性，并与常见金属离子和化学试剂有良好的配伍性。实验证明，与通常从蛋清中提取的溶菌酶相比较，从海参中分离纯化的溶菌酶具有广谱杀菌功能，即对常见的革兰氏阴性菌和阳性菌细胞壁均有溶解作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 溶菌酶的性质
• 1.1.1 溶菌酶的分型
• 1.1.1.1 c型溶菌酶
• 1.1.1.2 g型溶菌酶
• 1.1.1.3 噬菌体溶菌酶
• 1.1.1.4 植物溶菌酶
• 1.1.1.5 真菌与细菌溶菌酶
• 1.1.1.6 无脊椎型溶菌酶
• 1.1.2 溶菌酶的抗菌作用机制
• 1.2 溶菌酶的应用
• 1.2.1 溶菌酶在食品中的应用
• 1.2.1.1 溶菌酶在乳制品中的应用
• 1.2.1.2 溶菌酶在肉制品中的应用
• 1.2.1.3 溶菌酶在水果保鲜上的应用
• 1.2.1.4 溶菌酶在海产品和水产品保鲜上的应用
• 1.2.1.5 溶菌酶在低度酒及饮料中的应用
• 1.2.1.6 溶菌酶在降解壳聚糖上的应用
• 1.2.1.7 溶菌酶在其它食品中的应用
• 1.2.2 溶菌酶在生物医药上的应用
• 1.2.2.1 溶菌酶在基因工程和酶工程上的应用
• 1.2.2.2 溶菌酶在抗菌消炎、增强免疫力方面的应用
• 1.2.2.3 溶菌酶在多种疾病诊断方面的应用
• 1.2.2.4 溶菌酶在牙膏、洗手液等产品中的应用
• 1.3 溶菌酶的生产现状及前景
• 1.4 溶菌酶的分离纯化方法
• 1.4.1 结晶法
• 1.4.2 离子交换法
• 1.4.3 膜色谱技术
• 1.4.4 亲和膜色谱
• 1.4.5 离子交换膜色谱
• 1.4.6 超滤
• 1.4.7 反胶团萃取
• 1.4.8 以亲和力为基础的生物分离技术
• 1.4.8.1 固定金属亲和层析
• 1.4.8.2 亲和沉淀
• 1.4.8.3 亲和过滤法
• 1.4.9 扩张床吸附法
• 1.5 溶菌酶活力的测定方法
• 1.6 本文的主要研究内容
• 第二章 溶菌酶的提取
• 2.1 引言
• 2.2 材料与仪器
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 盐溶液提取
• 2.3.2 等渗溶液提取
• 2.3.3 有机溶剂提取
• 2.3.4 正丁醇提取
• 2.3.5 表面活性剂提取
• 2.3.6 溶菌酶活性的测定
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 盐溶液提取
• 2.4.2 等渗溶液提取
• 2.4.3 有机溶剂提取
• 2.4.4 正丁醇提取
• 2.4.5 表面活性剂提取
• 2.5 小结
• 第三章 溶菌酶的分离纯化
• 3.1 引言
• 3.2 材料与仪器
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 仪器
• 3.3 主要试剂的配制
• 3.3.1 抽提缓冲液的配制
• 3.3.2 标准蛋白溶液的配制
• 3.3.3 考马斯亮蓝G-250的配制
• 3.3.4 SDS-PAGE试剂的配制
• 3.4 实验方法
• 3.4.1 粗酶的制备
• 3.4.2 液体浓缩酶的制备
• 3.4.3 透析
• 3.4.3.1 透析袋的预处理
• 3.4.3.2 透析法改变溶剂成分
• 3.4.4 CM52纤维素阳离子交换柱层析分离纯化海参肠溶菌酶
• 3.4.4.1 CM52纤维素层析柱的预处理
• 3.4.4.2 CM52纤维素柱层析纯化海参肠溶菌酶
• 3.4.5 Sephadex G-75凝胶过滤柱层析分离纯化海参肠溶菌酶
• 3.4.5.1 Sephadex G-75凝胶过滤层析柱的预处理
• 3.4.5.2 Sephadex G-75凝胶过滤柱层析纯化海参肠溶菌酶
• 3.4.5.3 透析法除表面活性剂
• 3.4.6 溶菌酶分子量的测定
• 3.4.7 溶菌酶活性的测定
• 3.4.8 蛋白含量测定
• 3.5 结果与讨论
• 3.5.1 液体浓缩酶的制备
• 3.5.2 CM52纤维素柱层析纯化海参肠溶菌酶
• 3.5.3 Sephadex G-75凝胶过滤柱层析纯化海参肠溶菌酶
• 3.5.4 溶菌酶分子量测定
• 3.6 小结
• 第四章 溶菌酶的酶学性质
• 4.1 引言
• 4.2 材料与仪器
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 溶菌酶的最适作用 pH
• 4.3.2 溶菌酶的最适作用温度
• 4.3.3 溶菌酶的pH稳定性
• 4.3.4 溶菌酶的热稳定性
• 4.3.5 金属离子对酶活力的影响
• 4.3.6 酶对细菌的水解作用
• 4.3.6.1 指示菌培养
• 4.3.6.2 待测菌的制备
• 4.3.6.3 抑菌活性检测—管碟法
• 4.4 结论与讨论
• 4.4.1 溶菌酶的最适作用 pH
• 4.4.2 溶菌酶的最适作用温度
• 4.4.3 溶菌酶的pH稳定性
• 4.4.4 溶菌酶的热稳定性
• 4.4.5 金属离子对酶活力的影响
• 4.4.6 酶对细菌的水解作用
• 4.5 小结
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢