猪脑心肌炎病毒非结构蛋白3AB和3ABC基因的表达与3AB单克隆抗体的制备

论文摘要

脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus,EMCV）是一种重要的人畜共患病病原。EMCV感染最广泛和最严重的动物是猪,感染后仔猪可造成急性心肌炎等实质器官的广泛病理损伤甚至发生急性死亡;感染母猪可导致怀孕母猪流产、产死胎、弱胎、木乃伊胎等繁殖障碍。目前国内外该病的病原学诊断和血清学检测方法都是针对全病毒或结构蛋白,尚无针对非结构蛋白方面的检测方法的研究。EMCV预防临床最常用还是灭活苗,建立检测非结构蛋白的抗体的方法,可用于区别疫苗免疫和自然感染。EMCV和口蹄疫病毒（FMDV）同属微RNA病毒科,其基因结构类似。许多研究证明FMDV 3AB和3ABC ELISA方法能有效检测FMDv自然感染水平,但在EMCV研究方面尚无类似的报道。本研究通过原核和真核表达系统表达EMCV非结构蛋白3AB和3ABc,并制备3AB的单克隆抗体,主要内容包括:1.EMCV 3AB和3ABc基因原核表达与抗体制备:首先通过PCR方法从重组质粒pUC18-EMCV中分别扩增得到含完整阅读框的3AB和3ABC基因,克隆至原核高效表达载体pGEX-6p-1中,在E.coli BL21（DE3）细菌中分别成功表达了重组蛋白GST-3AB和GST-3ABC,大小分别为39kDa和62kDa。由于EMCV 3C蛋白为蛋白质水解酶,易从3ABC上解离下来,故部分GST-3ABC蛋白降解为GST-3AB和3C（22kDa）。取包涵体纯化的GST-3AB蛋白免疫清洁级小鼠,制备得到3AB蛋白的多克隆抗体。Western bolt结果显示,该抗体可与重组3AB和3ABC蛋白发生特异性反应。2.杆状病毒表达EMCV 3AB和3ABC基因:先将目的基因分别克隆至杆状病毒转座载体pFastBacTM中,提取阳性克隆质粒转化至DH10 Bac感受态细菌,通过蓝白斑筛选和PCR鉴定,将阳性重组杆状病毒穿梭载体经脂质体介导转染Sf9细胞获得重组杆状病毒,并经IFA和Western blot鉴定。试验结果显示两个目的蛋白在昆虫细胞中获得成功表达,重组3AB分子量约16kDa,重组3ABC蛋白仍然解离成3AB和3C。3.EMCV 3AB单克隆抗体制备:用纯化的GST-3AB蛋白免疫BALB/c小鼠并通过杂交瘤细胞技术制备其单克隆抗体,经间接ELISA筛选阳性的杂交瘤细胞,获得1株能稳定分泌抗3AB蛋白抗体的杂交瘤细胞株,将其命名为2D12,其亚类测定为IgG1/κ。Weatern Blot和间接免疫荧光试验证明该单抗能特异性识别3AB蛋白。成功获得了针对EMCV 3AB的特异性单抗。本研究通过基因工程手段成功表达获得EMCV非结构蛋白3AB和3ABC,并制备获得抗3AB的单多克隆抗体,为开展相关的非结构蛋白功能及血清学诊断方法研究奠定了重要基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 脑心肌炎病毒研究进展
• 1 EMCV分子生物学
• 2 流行病学
• 3 致病机理
• 4 EMCV诊断技术
• 5 EMCV疫苗研究
• 参考文献
• 第二章 猪脑心肌炎病毒非结构蛋白3AB和3ABC基因原核表达与抗体制备
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 第三章 猪脑心肌炎病毒非结构蛋白3AB和3ABC基因在重组杆状病毒中的表达与鉴定
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 第四章 猪脑心肌炎病毒非结构蛋白3AB单克隆抗体的制备与生物学特性鉴定
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文