论文摘要
目的:目前的研究发现大量,迅速的淋巴细胞凋亡是造成脓毒症免疫抑制的关键环节,也是影响预后的重要参数。在动物细胞中,线粒体通路是最普遍的凋亡机制和细胞凋亡核心。本实验采用盲肠结扎穿孔的方法复制小鼠脓毒症动物模型,观察脓毒症时小鼠脾脏淋巴细胞凋亡的情况,检测线粒体膜电位及细胞色素C在线粒体和胞浆内含量的变化,研究线粒体在脓毒症淋巴细胞凋亡的作用机制。方法:用雌性、6～8周、C57BL/6小鼠建立盲肠结扎穿孔（cecal ligation andpuncture,CLP）的脓毒症动物模型。将实验动物随机分为两组:对照组、CLP组。观察动物的一般情况及生存率变化。取肺脏、肝脏、脾脏、小肠行病理学检查,确证模型;分离脾淋巴细胞,采用AnnexinV—FITC/PI标记,流式细胞仪检测脾淋巴细胞的凋亡变化;罗丹明123标记,流式细胞仪检测线粒体膜电位的变化;分离脾淋巴细胞线粒体和胞浆组分,Western-blot检测细胞色素C在线粒体、胞浆中的含量变化。结果1)脓毒症动物模型的确认两组实验动物均术后很快苏醒,对照组无明显异常反应,且全部存活。CLP术后小鼠出现精神萎靡、嗜睡、反应迟钝、活动差、怕冷、聚居、竖毛、厌食、眼角分泌物增多等表现。CLP组小鼠的多脏器病理切片可见组织细胞结构改变和不同程度的炎细胞浸润,如肺泡腔内见炎性渗出物及脱落的肺泡上皮、肝细胞灶性坏死伴炎细胞浸润、脾脏白髓淋巴滤泡内大量呈灶性分布的淋巴细胞凋亡、小肠浆膜面出现大量的脓性渗出物。而对照组多脏器病理切片不见或少见异常。CLP组小鼠,24小时存活率达到80%左右,72h存活率为45%～55%,符合脓毒症动物模型标准。2)脾淋巴细胞凋亡的检测利用Annexin V—FITC/PI染色流式细胞仪检测小鼠脾淋巴细胞的凋亡变化,发现对照组脾淋巴细胞凋亡比例为（3.52±0.25）%,CLP组脾淋巴细胞的凋亡比例增高到（17.32±2.24）%,差别有统计学意义（P＜0.05）。证实脓毒症模型存在明显的淋巴细胞凋亡。3)线粒体膜电位的检测利用阳离子绿色荧光染料罗丹明123检测线粒体膜电位的变化,发现CLP组线粒体膜电位没有降低的细胞比例下降到（76.23±1.56）%,明显较对照组（99.62±0.37）%减少,差别有统计学意义（P＜0.05）。结果说明在脓毒症模型中,淋巴细胞凋亡时线粒体功能变化,起重要作用的线粒体膜电位明显降低。4)细胞色素C的检测通过Western-blot检测,从图片可直观地看到对照组线粒体内的细胞色素C呈强阳性表现,而CLP组线粒体内的细胞色素C呈弱阳性表现。对照组胞浆中的细胞色素C极少量,可视为阴性,而CLP组胞浆中的细胞色素C呈强阳性表现。经数据分析后得出CLP组脾淋巴细胞线粒体和胞浆内的细胞色素C含量与对照组相比,差异有统计学意义（P＜0.05,P＜0.01）。证实脓毒症时脾淋巴细胞线粒体内的细胞色素C释放到胞浆中。结论:1)依照文献报道建立的盲肠结扎穿孔模型,经过术后的一般情况和生存率变化,以及多脏器病理切片结果的验证,符合脓毒症模型标准,可用于进一步的实验研究。2)通过AnnexinV /PI染色流式细胞仪检测,结果显示在这个CLP脓毒症模型中可测到脾淋巴细胞大量凋亡。证实了脓毒症时存在淋巴细胞大量凋亡。淋巴细胞大量凋亡可通过造成免疫细胞无反应性或抗炎细胞因子的分泌等抑制机体免疫防御功能,从而加重脓毒症的病情变化。3)应用罗丹明123标记,流式细胞仪检测线粒体膜电位的变化,发现在脓毒症模型中脾淋巴细胞线粒体的膜电位明显降低;Westernblot检测到脓毒症模型脾淋巴细胞线粒体内的细胞色素C释放到胞浆中,诱导凋亡。上述结果表明在脓毒症中脾淋巴细胞线粒体功能发生明显变化,证实了线粒体在脓毒症淋巴细胞凋亡的关键作用。