白菜花粉发育相关基因BcMF13和BcMF14的分离及其功能验证

论文摘要

十字花科蔬菜是我国栽培面积最大、总产量最高、杂种优势利用最为普遍的蔬菜之一。发掘和创建其雄性不育系在生产实践中具有重要意义,一直以来深受人们重视。但是,雄性不育的产生机制仍然是一个尚未完全解开的谜,目前对其的认识是零散和不完全的,许多问题还有待深入研究。花粉发育相关基因的克隆和分析有助于通过反义技术等阻断与花粉发育有关基因的表达从而获得雄性不育植株。这些分子生物学理论与技术的应用,不仅为最终阐明植物雄性不育机制提供了条件。也将大大推动十字花科作物和其他农作物杂种优势的有效应用。本实验室采用cDNA-AFLP技术从白菜（Brassica campestris L.ssp.chinensis Markino,syn.B.rapa ssp.chinensis）减数分裂胞质分裂突变体mmc（male meiotic cytokinesis）的野生型（可育株）中分离到两个与花粉育性密切相关的差异片段A8T4和A9T15,本研究以其为研究对象,通过PCR扩增方法对其基因组全长和cDNA全长进行克隆、鉴定,以及蛋白质结构和功能的预测,并以十字花科不同种属的植物为材料进行同源序列克隆、鉴定,并构建分子进化树,探讨其进化关系。并运用反义和RNA干涉技术,对菜心[B.campestris L.ssp.chinensis Markino var.parachinensis（Bailey）Tsen et Lee]进行转化,以获得这两个基因功能缺失突变体,从而分析其在花粉发育进程中的生物学功能。获得的主要结果如下:（1）根据差异片段A8T4和A9T15序列设计引物,利用RACE技术获得花粉发育相关基因的cDNA和DNA序列全长,分别命名为Brassica campestris Male Fertility 13（BcMF13）和Brussicacampestris Male Fertility 14（BcMF14）。序列分析表明,BcMF13的cDNA序列全长为600bp,含有2个外显子和1个长度为106bp的内含子。cDNA序列的最大开放阅读框（open reading frame,ORF）为222bp,编码73个氨基酸。在GenBank数据库中没有发现与BcMF13同源性很高的基因,表明BcMF13是一个新基因。BcMF13在可育株系‘Bajh97-01/B’的的Ⅳ～Ⅴ级花蕾中特异表达,尤其在雄蕊中表达量很高,在不育株系‘Bajh97-01A’中不表达,并且EST数据库中相似性很高的序列都来源于芸薹属的生殖器官,因此初步推断BcMF13很可能参与芸薹属花粉的发育过程。BcMF14的ORF为240个碱基,编码79个氨基酸,软件分析表明BcMF14的核酸序列和编码的BcMF14序列均符合RALF的特征,表明该基因是白菜中快速碱化因子类信号分子。（2）根据BcMF13的全长序列设计引物,在十字花科芸薹属植物的8个物种中克隆到BcMF13的同源序列,BcMF13同源基因在核苷酸水平和氨基酸水平相似性分别为80.0%～96.9%和96.7%～99.9%。在序列同源比对的基础上,基于Kimura双参数距离,构建了BcMF13同源基因在芸薹属植物8个物种中的NJ、ME和MP分子进化树,3种分子树的拓扑图总体趋势相同,有较高的一致性,表明用BcMF13序列得到的系统树能客观地反映BcMF13类基因在这些物种中的进化关系。（3）根据白菜BcMF14的全长序列设计引物,分别在十字花科5个属17份材料中扩增到BcMF14的同源序列,表明该基因在十字花科植物中广泛存在,进一步扩大了快速碱化因子的基因家族成员。并且这17个同源基因在核苷酸水平和氨基酸水平均有很高的相似性,编码的氨基酸都含有快速碱化因子蛋白的特征:一个保守的“YIXY”区和4个保守的半胱氨酸残基。说明该基因在十字花科植物中进化速度较慢,它们可能在其发育过程中发挥重要的作用。（4）利用BcMF13构建了含有组成型启动子CaMV35S的RNA反义载体pBI35S-AMF13和干涉载体pBI35S-RMF13,并利用农杆菌介导的方法将构建的BcMF13反义载体和干涉载体导入菜心中,分别获得了BcMF13的反义和干涉菜心转基因植株。利用BcMF14构建了含有组成型启动子CaMV35S的RNA反义载体pBI35S-AMF14和含有绒毡层特异表达启动子BcA9的RNA反义载体pBIBcA9-AMF14,并利用农杆菌介导的方法将构建的BcMF14的反义载体导入菜心中,获得了反义BcMF14菜心转基因植株。（5）用BcMF13 cDNA序列作探针的Northern杂交结果表明,BcMF13在含有CaMV35S启动子的反义载体和干涉载体的菜心转基因植株花蕾中的表达比对照都有降低,而干涉载体比反义载体对BcMF13表达水平的降低程度要大一些,说明干涉技术对白菜BcMF13的沉默效果要好于反义技术。透射电镜观察发现BcMF13受到反义和干涉抑制后,使花粉的发育在减数分裂前期就出现异常,在四分体时期小孢子和绒毡层细胞受到严重影响,从而导致正常的成熟花粉数量锐减。花粉萌发实验表明,pBI35S-AMF13菜心转基因植株花粉的萌发率为34.23%,显著低于对照的78.17%,而扫描电镜下的花粉畸形率达到54.66%。这种情况在转干涉基因的菜心植株中更明显:pBI35S-RMF13菜心转基因植株花粉的萌发率只有26.27%;花粉畸形率比转反义基因的稍高,达到57.55%。柱头萌发比体外萌发更能说明花粉正常与否,对受精后的柱头进行苯胺蓝染色观察发现转基因菜心的花粉管在柱头中的生长速度明显减慢。（6）用BcMF14 300-bp长的cDNA序列作探针,对菜心转基因植株大花蕾的Northern杂交结果表明,BcMF14在含有不同启动子反义载体的转基因菜心中的表达都受到不同程度的抑制,其中pBIBcA9-AMF14比pBI35S-AMF14的反义转基因植株中的表达量降低幅度更明显,说明BcA9启动子对BcMF14反义基因在花蕾中的启动效果要优于CaMV35S启动子。BcMF14的表达受到了抑制,一方面说明BcMF14为一在花粉中起作用的RALF基因,另一方面也验证了CaMV35S启动子在菜心花粉中具有启动活性。在对菜心转BcMF14反义基因植株和转空载体对照植株的细胞学观察和透射电镜的观察中均发现,转基因植株与对照株在四分体时期以前的小孢子发育阶段没有明显差别,而两种转基因菜心花粉在发育到四分体阶段都出现异常,说明BcMF14很可能作用在白菜小孢子发育的四分体时期。BcMF14除了直接影响小孢子发育以外,还对绒毡层的发育产生了影响。推测BcMF14基因在小孢子和绒毡层之间的信号、物质联络中有一定的作用。pBI35S-AMF14、pBIBcA9-AMF14反义载体菜心转基因植株花粉在扫描电镜下的花粉畸形率分别为48.95%和51.2%,花粉的体外萌发率分别为44.39%和26.09%,花粉在柱头上的萌发和对照相比,只有部分花粉管能生长到达花柱底部,这表明反义技术使得BcMF14的表达量降低,导致花粉发育异常,产生大量畸形花粉,最终导到花粉萌发率下降。这表明快速碱化因子类基因家族中的确存在一些调控植物花粉发育的RALF信号分子。这与Bedinger等对在番茄花粉中特异表达的PRALF基因进行研究结果相吻合,PRALF或BcMF14的过量或缺失表达都能引起花粉萌发异常,进而影响花粉管的生长。

论文目录

• 致谢
• 缩写词
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 文献综述
• 1.1 植物雄性不育的细胞学与生理生化研究进展
• 1.1.1 植物雄性不育的细胞学研究
• 1.1.1.1 雄性败育的主要时期
• 1.1.1.2 雄性败育的主要表现及鉴定方法
• 1.1.1.3 花药壁发育与雄性败育
• 1.1.2 植物雄性不育的生理生化研究
• 1.2 植物花粉发育的分子生物学研究进展
• 1.2.1 植物花粉发育相关基因的克隆与研究
• 1.2.1.1 与花粉发育起始相关基因的研究
• 1.2.1.2 与小孢子母细胞发育相关基因的研究
• 1.2.1.3 与花粉有丝分裂相关的基因的研究
• 1.3 反义技术和RNA干涉技术的研究
• 1.3.1 反义RNA技术
• 1.3.1.1 反义RNA的作用原理
• 1.3.1.2 反义RNA的设计
• 1.3.1.3 反义RNA技术的应用
• 1.3.2 RNA干涉技术
• 1.3.2.1 RNA干涉的作用机制
• 1.3.2.2 RNA干涉技术的一般技术路线
• 1.3.2.3 RNA干涉技术的应用
• 1.4 快速碱化因子的研究进展
• 1.4.1 快速碱化因子的同源基因与表达
• 1.4.1.1 快速碱化因子的同源基因及特征
• 1.4.1.2 快速碱化因子基因的表达
• 1.4.2 快速碱化因子多肽的结构
• 1.4.3 快速碱化因子的生理作用
• 1.4.3.1 使培养基快速碱化
• 1.4.3.2 诱导胞内有丝分裂蛋白激酶合成
• 1.4.3.3 抑制根的生长
• 1.4.3.4 其它
• 2 白菜花粉发育相关新基因BcMF13的克隆及序列分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 植物材料与试剂
• 2.1.2 基因组DNA和总RNA的提取及反转录
• 2.1.3 差异片段的5'RACE和3'RACE扩增
• 2.1.4 cDNA和DNA序列全长的扩增
• 2.1.5 序列分析
• 2.1.6 表达分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 A8T4片段分析后发现正义链
• 2.2.2 A8T4的5'RACE扩增
• 2.2.3 A8T4的5'RACE测序分析
• 2.2.4 A8T4的3'RACE扩增
• 2.2.5 A8T4的3'RACE扩增片段的测序分析
• 2.2.6 BcMF13 cDNA和DNA序列全长的获得
• 2.2.7 BcMF13的序列特征分析
• 2.2.8 BcMF13的表达分析
• 2.3 讨论
• 3 几种芸薹属蔬菜BcMF13同源基因的克隆及进化分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 DNA的提取及同源基因的克隆
• 3.1.3 BcMF13同源基因的序列差异分析
• 3.1.4 同源基因的进化分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 BcMF13同源序列的扩增和克隆
• 3.2.2 BcMF13同源基因的序列特征分析
• 3.2.3 BcMF13同源基因的序列比对
• 3.2.4 芸薹属BcMF13同源基因序列的遗传距离分析
• 3.2.5 芸薹属BcMF13同源基因的分子进化
• 3.3 讨论
• 3.3.1 BcMF13是芸薹属中广泛存在的一类保守性基因
• 3.3.2 BcMF13同源基因的进化
• 4 白菜花粉发育相关新基因BcMF13的功能分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 植物材料与试剂
• 4.1.2 RNAi载体构建
• 4.1.2.1 菌株与质粒
• 4.1.2.2 正义片段和反义片段的获得
• 4.1.2.3 反义片段和正义片段的制备
• 4.1.2.4 双元载体pBI121制备
• 4.1.2.5 表达质粒的构建
• 4.1.2.6 冻融法转化农杆菌
• 4.1.2.7 农杆菌中质粒的鉴定
• 4.1.3 反义RNA载体的构建
• 4.1.3.1 菌株与质粒
• 4.1.3.2 反义RNA载体的构建流程
• 4.1.3.3 获取反义片段
• 4.1.3.4 双元载体pBI121制备
• 4.1.3.5 表达质粒的构建
• 4.1.3.6 冻融法转化农杆菌
• 4.1.3.7 农杆菌中质粒的鉴定
• 4.1.4 转基因植株的获得
• 4.1.4.1 植物材料、菌株及抗生素
• 4.1.4.2 培养基
• 4.1.4.3 播种
• 4.1.4.4 预培养
• 4.1.4.5 共培养
• 4.1.4.6 分化培养
• 4.1.4.7 继代及生根培养
• 4.1.4.8 练苗与移栽
• 4.1.5 转基因植株的分子检测
• 4.1.5.1 植物材料及试剂
• 4.1.5.2 转基因植株基因组DNA和总RNA的提取
• 4.1.5.3 转基因植株的PCR检测
• 4.1.5.4 转基因植株的Southern印迹杂交检测
• 4.1.5.5 转基因植株的Northern印迹杂交检测
• 4.1.6 转基因植株的花粉发育的形态学与细胞学观察
• 4.1.6.1 试验材料及试剂
• 4.1.6.2 转基因植株花粉的扫描及透射电镜观察
• 4.1.6.3 转基因植株花粉生活力观察
• 4.1.6.4 转基因植株的花粉萌发试验
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 获得BcMF13 RNAi载体
• 4.2.1.1 获得BcMF13正义片段和反义片段
• 4.2.1.2 BcMF13干涉载体在农杆菌中的鉴定
• 4.2.2 获得BcMF13 RNA反义载体
• 4.2.2.1 获得BcMF13反义片段
• 4.2.2.2 BcMF13的35S-PBI121反义表达载体在农杆菌中的鉴定
• 4.2.3 获得BcMF13反义载体和干涉载体菜心转化植株
• 4.2.4 BcMF13反义载体和干涉载体转基因植株的分子检测
• 4.2.4.1 BcMF13反义载体和干涉载体菜心转基因植株的总DNA提取
• 4.2.4.2 BcMF13反义载体和干涉载体菜心转基因植株的PCR检测
• 4.2.4.3 BcMF13反义载体和干涉载体菜心转基因植株的Southern杂交检测
• 4.2.4.4 BcMF13反义载体和干涉载体菜心转基因植株的Northern杂交检测
• 4.2.5 BcMF13菜心反义载体和干涉载体转基因植株花粉发育的形态和细胞学观察
• 4.2.5.1 BcMF13反义载体和干涉载体菜心转基因植株花粉发育的形态学观察
• 4.2.5.2 BcMF13反义载体和干涉载体菜心转基因植株花粉的扫描电镜观察
• 4.2.5.3 BcMF13反义载体和干涉载体菜心转基因植株花粉的透射电镜观察
• 4.2.5.4 BcMF13反义载体和干涉载体菜心转基因植株花粉苯胺蓝染色观察
• 4.2.5.5 BcMF13反义载体和干涉载体菜心转基因植株花粉DAPI染色观察
• 4.2.5.6 BcMF13反义载体和干涉载体菜心转基因植株花粉体外萌发观察
• 4.2.5.7 BcMF13反义载体和干涉载体菜心转基因植株花粉柱头萌发观察
• 4.3 讨论
• 4.3.1 BcMF13是一个新的白菜花粉发育相关基因
• 4.3.2 BcMF13在白菜花粉发育过程中的功能
• 5 白菜花粉发育相关的快速碱化因子基因BcMF14的克隆及分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 植物材料与试剂
• 5.1.2 5'RACE和3'RACE扩增
• 5.1.3 cDNA和DNA序列全长的扩增
• 5.1.4 序列分析
• 5.1.5 表达分析
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 A9T15片段的分析
• 5.2.2 A9T15的5'RACE扩增
• 5.2.3 A9T15的5'RACE测序分析
• 5.2.4 A9T15的3'RACE扩增
• 5.2.5 A9T15的3'RACE测序分析
• 5.2.6 BcMF14基因cDNA和DNA序列全长的获得
• 5.2.7 BcMF14的序列特征分析
• 5.2.8 BcMF14的表达分析
• 5.3 讨论
• 6 十字花科植物BcMF14同源基因的克隆及进化分析
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 试验材料
• 6.1.2 DNA的提取及同源基因的克隆
• 6.1.3 同源基因的序列差异分析
• 6.1.4 同源基因的进化分析
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 BcMF14同源序列的扩增和克隆
• 6.2.2 BcMF14同源基因的碱基序列分析
• 6.2.3 十字花科BcMF14同源基因氨基酸的序列分析
• 6.2.4 BcMF14同源基因的核苷酸序列比对
• 6.2.5 十字花科植物BcMF14基因的进化关系
• 6.3 讨论
• 6.3.1 快速碱化因子基因在十字花科植物中广泛存在
• 6.3.2 十字花科植物BcMF14同源基因的系统进化
• 7 白菜花粉发育相关的快速碱化因子基因BcMF14的功能分析
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 BcMF14基因反义载体的构建
• 7.1.1.1 菌株与质粒
• 7.1.1.2 反义片段的获得
• 7.1.1.3 双元载体pBI121制备
• 7.1.1.4 表达质粒的构建
• 7.1.1.5 冻融法转化农杆菌
• 7.1.1.6 农杆菌中质粒的鉴定
• 7.1.2 转基因植株的获得
• 7.1.2.1 植物材料、菌株及抗生素
• 7.1.2.2 培养基
• 7.1.2.3 播种
• 7.1.2.4 预培养
• 7.1.2.5 共培养
• 7.1.2.6 分化培养
• 7.1.2.7 继代及生根培养
• 7.1.2.8 练苗、移栽
• 7.1.3 转基因植株的分子检测
• 7.1.3.1 植物材料及试剂
• 7.1.3.2 转反义基因植株基因组DNA和总RNA的提取
• 7.1.3.3 转反义基因植株的PCR检测
• 7.1.3.4 转反义基因植株的Southern印迹杂交检测
• 7.1.3.5 转反义基因植株的Northern印迹杂交检测
• 7.1.4 转反义基因植株小孢子发育的形态学与细胞学观察
• 7.1.4.1 试验材料
• 7.1.4.2 转反义基因植株花粉的扫描电镜观察
• 7.1.4.3 转反义基因植株花粉的透射电镜观察
• 7.1.4.4 转反义基因植株花粉的细胞学观察
• 7.1.5 转反义基因植株花粉生活力观察
• 7.1.5.1 转反义基因植株花粉苯胺蓝染色观察
• 7.1.5.2 转反义基因植株花粉DAPI染色观察
• 7.1.6 转反义基因植株的花粉萌发试验
• 7.1.6.1 转反义基因植株花粉体外萌发观察
• 7.1.6.2 转反义基因植株花粉柱头萌发观察
• 7.2 结果与分析
• 7.2.1 获得BcMF14反义片段及其载体
• 7.2.1.1 获得BcMF14反义片段
• 7.2.1.2 BcMF14反义载体的构建及在农杆菌中质粒的鉴定
• 7.2.2 获得菜心反义BcMF14转化植株
• 7.2.3 菜心反义BcMF14转基因植株的分子检测
• 7.2.3.1 菜心反义BcMF14转基因植株的总DNA提取
• 7.2.3.2 菜心反义BcMF14转基因植株的PCR检测
• 7.2.3.3 菜心反义BcMF14转基因植株的Southern杂交检测
• 7.2.3.4 菜心反义BcMF14转基因植株的Northern杂交检测
• 7.2.4 菜心反义BcMF14转基因植株花粉发育的形态和细胞学观察
• 7.2.4.1 菜心反义BcMF14转基因植株花粉的扫描电镜观察
• 7.2.4.2 菜心反义BcMF14转基因植株花粉的透射电镜观察
• 7.2.4.3 菜心反义BcMF14转基因植株花粉的细胞学观察
• 7.2.5 菜心反义BcMF14转基因植株花粉生活力观察
• 7.2.5.1 菜心反义BcMF14转基因植株花粉苯胺蓝染色观察
• 7.2.5.2 菜心反义BcMF14转基因植株花粉DAPI染色观察
• 7.2.6 菜心反义BcMF14转基因植株的花粉萌发试验
• 7.2.6.1 菜心反义BcMF14转基因植株花粉体外萌发观察
• 7.2.6.2 菜心反义BcMF14转基因植株花粉柱头萌发观察
• 7.3 讨论
• 7.3.1 BcMF14是一个新的白菜快速碱化因子类基因
• 7.3.2 CaMV35S和BcA9启动子在菜心花粉中的活性
• 7.3.3 BcMF14在白菜花粉发育过程中的可能功能
• 结论
• 参考文献
• 博士期间发表的论文