论文摘要
研究背景及目的目前已有多项基础和临床研究证实骨髓间充质干细胞（MSC）移植可修复受损心肌、显著改善心肌梗死后心功能,但由于不适应缺血缺氧、炎症、凋亡因子等恶劣的宿主环境,移植细胞的90%以上在短期内死亡,这大大降低了干细胞在心肌损伤修复中的效果。因此,选择合适的基因对MSC进行修饰可能是提高细胞的移植存活率和治疗效果的一条有效途径。鞘氨醇激酶-1（SPK1）是近年来受到广泛关注的一种与细胞生命活动调节密切相关的蛋白激酶,它通过调节鞘磷脂代谢平衡对细胞生长、分化和程序性死亡起重要作用,其催化产物1-磷酸鞘氨醇有促进细胞增殖及血管新生的作用。我们的前期研究已证实,腺病毒介导SPK1基因（Ad-SPK）心肌内注射能有效地抑制心脏缺血-再灌注损伤、减轻缺血性心力衰竭。因此我们推断,SPK1基因转导可起到增加MSC移植细胞存活率、进一步改善缺血性心脏病心功能的作用。本课题旨在研究腺病毒介导的SPK1基因修饰对骨髓MSC的移植存活率以及对缺血性心脏病心功能的影响,明确SPK1基因修饰MSC移植治疗急性心肌梗死可行性和有效性,为今后临床研究奠定实验基础。方法1.2周龄Wistar大鼠,采用Percoll密度梯度离心与贴壁培养相结合的方法,自股骨和胫骨骨髓中分离培养MSC,用显微镜观察细胞形态,并通过体外向成骨细胞和成脂细胞诱导分化间接鉴定MSC;流式细胞仪检测携带绿色荧光蛋白的腺病毒载体（Ad-GFP）感染MSC的效率。2.用293细胞扩增、氯化铯密度梯度离心法纯化Ad-SPK,TCID50法测病毒滴度;根据不同感染强度（MOI）的Ad-SPK体外感染MSC48小时后SPK1蛋白表达及酶活性的变化确定Ad-SPK感染MSC的最佳感染强度,并以此强度感染MSC后不同时间测定SPK1的蛋白表达及酶活性,确定SPK1的表达时效。3.体外研究转染SPK1基因对MSC细胞增殖、细胞周期及成脂、成骨细胞分化能力的影响,以及对抗去血清凋亡能力的变化。4.用分子克隆的方法构建萤火虫荧光素酶基因（fluc）逆转录病毒表达载体[pL（fluc）SN],筛选稳定表达fluc报告基因的逆转录病毒包装细胞GPE+86和PA317,测定病毒滴度并检测包装细胞荧光素酶活性。5.用逆转录病毒载体介导fluc报告基因标记小鼠骨髓间充质干细胞,应用活体成像技术观察MSC移植入小鼠正常的骨骼肌后在体存活情况。6.用逆转录病毒载体介导fluc报告基因标记大鼠骨髓间充质干细胞,应用生物发光技术检测SPK1修饰或不修饰的MSC移植到大鼠缺血心脏后的存活情况。7.结扎左前降支建立大鼠急性心肌梗死（AMI）模型,结扎后30分钟于缺血区分四点心肌内注射1×106/0.1ml的SPK1修饰的MSC（MSC-SPK组）、GFP标记的Msc（MsC-GFP组）、PBS（AMI组）,每组10只,另取5只假手术作为对照（SHAM组）。监测细胞移植后血流动力学、血浆心房利钠肽（ANP）、超声心功能、心室重构、血管新生等的变化。结果1.自wistar大鼠骨髓分离的MSC贴壁生长,呈成纤维细胞样,原代细胞7-10天可达到80%融合生长,传代细胞生长旺盛,生长曲线示3天生长可达高峰,经特殊诱导剂诱导后可向成骨细胞和成脂细胞分化。Ad-GFP感染MSC48小时后的感染效率高达97.82%。2.在293细胞中大量扩增携带SPK1的重组腺病毒,经氯化铯密度梯度超速离心后获得病毒滴度约6×1010Iu/ml;以不同梯度MOI感染MSC 48小时后SPK1蛋白表达及细胞内SPK1酶活性确定Ad-SPK感染MSC的最佳强度为150pfu/cell,蛋白表达持续至少10天,并维持较高的酶活性。3.SPK1基因转染对MSC的细胞增殖能力、细胞周期、成骨及成脂分化潜能无显著影响,但去血清培养48小时MSC-SPK较Msc早期及晚期凋亡数目显著降低（48.75%VS 17.44%,P<0.01）。4.成功构建荧光素酶逆转录病毒表达载体,并筛选出稳定表达荧光素酶、产病毒滴度较高的逆转录病毒包装细胞（GP+E86/fluc及PA317/fluc）。5.应用rv-fluc感染小鼠骨髓间充质干细胞,初步应用活体成像技术观察MSC移植入正常的骨骼肌后在体存活情况,显示MSC移植后3天细胞存活不足10%。6.应用fluc标记大鼠骨髓间充质干细胞,体外应用Ad-GFP或Ad-SPK修饰后移植入缺血心肌,研究发现随着移植时间的延长细胞存活数目逐渐减少,3天内移植细胞死亡率高达90%以上,但SPK1基因修饰可改善MSC移植早期（5天内）存活率。7.急性心肌梗死后大鼠血流动力学恶化,左心室扩张、球形变,非梗死区胶原增生纤维化,血浆心钠肽水平增加,心功能严重受损:MSC-GPF及MSC-SPK移植均可有效改善大鼠的血流动力学,降低左室舒张末压,减少非梗死区胶原沉积,增加新生血管密度,降低心钠肽,改善左心功能:MSC-SPK较MSC-GFP移植能进一步降低左室舒张末压、缩小梗死面积,促进血管新生,抑制左心室的球形变。结论1.骨髓MSC分离方法简便,体外扩增容易,有多向分化潜能,体外腺病毒载体感染效率高,是理想的组织工程及基因工程种子细胞。2.腺病毒载体介导SPK1基因可高效转染MSC,稳定表达目的基因,持续时间适中,对MSC的生长周期、增殖及分化能力无明显影响,是适宜的基因转移载体。3.骨髓间充质干细胞移植入正常或缺血组织后早期移植细胞死亡率均较高,达90%以上;SPK1修饰的MSC虽在体外抗去血清凋亡能力显著增强;但移植入缺血心肌后仅可改善移植早期（5天内）细胞存活率。4.MSC-GFP及MSC-SPK移植均可改善急性心肌梗死后大鼠的心功能、轻度抑制心室重构,增加新生血管密度;MSC-SPK在降低左室舒张末压、减小梗死面积、促进血管新生及维持左心室相对正常形态方面优于未修饰的MSC。
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