甘蓝型油菜显性核不育雄配子发育相关基因Bnrad23的克隆及初步分析

论文摘要

油菜是食用植物油和植物蛋白的最主要来源,也是潜在的仅次于豆粕的大宗饲用蛋白源,而且在现代工业上的用途也日益广泛。随着人们生活水平的不断提高,对油菜产量和品质的要求也相应提高,因此,开展油菜杂种优势利用研究,把品质育种与杂种优势利用结合起来,选育高产优质油菜品种已成为目前油菜育种的主攻方向。油菜雄性不育无疑是利用油菜杂种优势的一个有效途径,并且已经广泛地应用于生产实践。关于甘蓝型油菜的不育机制,一直以来是人们所研究的热点,吴建勇（2006）构建了甘蓝型油菜显性核不育材料Rs1046AB的抑制差减（SSH）文库,研究表明雄配子发育的各个时期有212个表达序列标签（EST）存在差异表达,并且就显性核不育的不育机制提出假设,即不育材料中Rad23基因表达很微弱,从而导致不能正常识别DNA的损伤,因此在花粉母细胞发育的早期就产生了各种各样的减数分裂不正常行为,并最终导致不育花粉的产生。研究表明,参与DNA修复的Rad23蛋白具有类似泛素（ubiquitin）的功能,并且与DNA损伤修复因子（XPC）结合,一起识别损伤的部位。如果Rad23基因失活,则不能有效地进行DNA修复,增加了细胞对紫外辐射的敏感度,引起细胞的损伤。本研究以甘蓝型油菜显性核不育纯合两型系Rs1046AB,隐性核不育9012AB,为研究对象,在Rs1046AB的SSH文库中选取可能与小孢子发育阶段DNA修复有关的的2个EST:1-B09,GenBank登录号为EE392255;2-I05,GenBank登录号为EE392341。希望通过RACE技术,得到全长cDNA,进一步获得基因组的信息,获得以下结果:1、采用RACE技术,从油菜Rs1046AB花粉中克隆得到候选EST:1-B09的全长cDNA,命名为Brassica napus DNA repair protein RAD23 gene,（Bnrad23 gene）GeneBank登录号为EU306600;并且克隆了部分启动子序列,与编码区一起命名为Brassica napus RAD23-like gene,promoter region,5′UTR,and complete sequence,GeneBank登录号为EU306601;另一个侯选EST:2-I05的部分cDNA序列,命名为Brassica napus RAD23-like protein cDNA,GeneBank登录号为EU306599。此外,本研究还对Brassica napus rad23蛋白的性质及结构进行了部分预测。2、通过半定量RT-PCR,分析了2种EST在Rs1046AB,9012AB中的表达情况,探讨了与DNA修复相关的基因与甘蓝型油菜雄配子败育的联系与可能的机制。3、通过染色体步移的方法,克隆了1-B09的部分启动子区域,通过生物信息学分析,发现包括2个TATAbox,3个CAAT框,5个GATAbox,多处在启动基因花粉特异性表达中起重要作用的顺式元件,以及多种与胁迫相关的顺式元件。并且在Rs1046AB的不育和可育株中,扩增出Bnrad23的基因组序列,通过比较,发现二者在基因组水平上并不存在差异。4、通过对获得的2-I05的部分序列与1-B09全长cDNA比较,发现2-I05已包含了完整的编码区域,并且通过分析,认为这两个基因可能属于同一个基因家族。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 论文中缩写说明表
• 1.前言
• 1.1 油菜雄性不育的研究
• 1.1.1 油菜细胞质不育
• 1.1.2 油菜核不育
• 1.2 植物雄配子发育研究
• 1.2.1 雄配子败育的相关因素及基因
• 1.3 RAD基因的研究进展
• 1.3.1 RAD基因的功能
• 1.3.2 RAD基因的研究
• 1.4 XPC基因的研究进展
• 1.4.1 NER修复过程
• 1.4.2 XPC基因的研究
• 1.5 克隆全长cDNA技术
• 1.5.1 克隆全长cDNA常用方法
• 1.5.2 EST技术的应用
• 1.6 植物启动子特征及克隆启动子的方法
• 1.6.1 植物启动子特征
• 1.6.2 植物启动子的分类
• 1.6.3 植物启动子的克隆方法
• 1.7 本课题研究的目的和意义
• 2.材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 Bnrad23基因全长cDNA的克隆测序分析
• 2.2.1 总RNA的提取
• 2.2.2 利用RACE技术分别获得Bnrad23基因的两端侧翼序列
• 2.2.2.1 3'Race扩增
• 2.2.2.2 5'Race扩增
• 2.2.3 RACE产物的检测、纯化及克隆测序
• 2.2.3.1 RACE产物的检测
• 2.2.3.2 RACE产物的纯化
• 2.2.3.3 RACE产物的克隆测序
• 2.2.3.4 RACE技术所获cDNA序列的生物信息学分析
• 2.2.4 基因组DNA序列的克隆
• 2.2.4.1 引物设计
• 2.2.4.2 基因组DNA提取
• 2.2.4.3 基因组扩增
• 2.2.4.4 基因组DNA序列分析
• 2.3 半定量RT-PCR
• 2.3.1 Rs1046AB和9012AB的RNA提取
• 2.3.2 引物设计
• 2.3.3 循环数确定
• 2.3.4 半定量PCR检测
• 2.4 Bnrad23基因启动子的分离测序
• 2.4.1 合成寡核苷酸制作接头
• 2.4.2 Bnrad23基因启动子的分离及序列测定
• 2.4.2.1 限制性内切酶消化基因组DNA
• 2.4.2.2 纯化DNA片段
• 2.4.2.3 接头与纯化后酶切产物的连接
• 2.4.2.4 巢式PCR扩增
• 3 结果与分析
• 3.1 总RNA质量检测和浓度测定
• 3.2 Bnrad23基因全长cDNA克隆及序列分析
• 3.2.1 3'RACE扩增Bnrad23基因3'端侧翼序列
• 3.2.2 5'RACE扩增Bnrad23基因5'端侧翼序列
• 3.2.3 Bnrad23基因组全长扩增结果
• 3.2.4 序列结构分析
• 3.2.4.1 Bnrad23基因全长cDNA序列阅读框分析
• 3.2.4.2 Bnrad23基因编码蛋白分析
• 3.3 Bnrad23基因组DNA序列分析
• 3.3.1 基因组预测
• 3.3.2 Bnrad23基因在Rs1046AB中的序列比对
• 3.4 Bnrad23基因启动子的分离
• 3.5 Bnrad23基因编码区在9012AB中的扩增
• 3.6 Brassica napus RAD23-like protein cDNA的克隆
• 3.6.1 Brassica napus RAD23-like protein cDNA的部分cDNA克隆
• 3.6.2 Brassica napus RAD23-like protein cDNA序列分析和蛋白预测
• 3.7 2个EST的半定量结果
• 3.7.1 指数期循环参数的确定
• 3.7.2 半定量RT-PCR的结果
• 4.讨论
• 4.1 部分技术手段的讨论
• 4.2 实验结果的讨论
• 4.3 下一步研究策略
• 参考文献
• 致谢
• 附录1 Bnrad23全长cDNA
• 附录2 Bnrad23基因组信息（含部分启动子序列）
• 附录3 Brassica napus RAD23-like protein cDNA序列
• 附录4 UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒操作说明
• 附录5 热激感受态的制备
• 附录6 总RNA提取
• 附录7 大量法提取油菜总DNA