联合应用Mcl-1的shRNA重组质粒增强人肝癌细胞HepG2化疗敏感性及其机制探讨

论文摘要

研究背景与目的髓样细胞白血病-1（myeloid cell leukemia-1,Mcl-1）基因是Bcl-2基因家族中一员,属于抗凋亡因子。Mcl-1表达失衡可导致肿瘤的发生,其过表达还可以保护肿瘤细胞免受药物诱导的细胞凋亡。Mcl-1基因定位在不同的细胞内膜,特别是线粒体外膜,这种定位可以使Mcl-1在凋亡过程中对线粒体中发生的重要事件进行调节。近来越来越多的研究证实其在人类肿瘤组织及其肿瘤细胞系中过表达,并且在结肠癌肝转移的患者中,其高表达预示对化疗药物耐药。因此研究Mcl-1基因对了解肿瘤发生的可能机制及抗肿瘤治疗的可能途径有重要意义,是未来新的抗癌治疗策略中的一个新靶点。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K）/丝氨酸/苏氨酸激酶（Akt）在肿瘤细胞信号转导中起着重要调节作用。恶性肿瘤中PI3K/Akt信号转导通路异常激活,刺激肿瘤细胞恶性增殖和血管形成,增强肿瘤细胞的侵袭转移能力。除此之外,PI3K/Akt信号转导通路还可通过调节Bcl-2家族成员的活性,发挥抗凋亡作用。但是,Mcl-1作为Bcl-2家族中抗凋亡蛋白成员之一,与该信号转导通路之间的关系目前尚不完全明确。为此,本研究设计并构建以Mcl-1为靶点的短发夹状RNA（short hairpin RNA,shRNA）重组质粒,观察shRNA对人肝癌细胞HepG2中Mcl-1表达的影响及下调Mcl-1表达对肝癌细胞生长及凋亡的影响,同时联合化疗药物丝裂霉素（Mitomycin C,MMC）或PI3K/AKT特异性抑制剂后观察对HepG2细胞生长抑制和凋亡的影响,并初步探讨Mcl-1表达的调控机制,是否与抑癌基因产物p53相关。方法设计3对针对Mcl-1基因不同位点的shRNA片段,构建携带此shRNA片段的真核表达载体psiRNA-Hhneo-Mcl-1,通过脂质体介导的方法将重组质粒转染到肝癌细胞株HepG2细胞中。采用RT-PCR及Western-blot方法检测Mcl-1的mRNA及蛋白表达情况,比较转染前后其表达差异。同时用PI3K/Akt抑制剂LY294002作用于HepG2细胞,观察其对Mcl-1表达的影响。分别利用MTT比色法和流式细胞仪检测靶向Mcl-1的shRNA以及联合应用化疗药物MMC或PI3K/Akt特异性抑制剂LY294002后对HepG2细胞生长情况和细胞凋亡的影响。收集30例原发性肝癌患者手术切除肝癌组织和癌旁组织标本,用免疫组化染色检测Mcl-1和p53表达情况,探讨两者之间的相关性。用RT-PCR方法分别检测不同人肝癌细胞HepG2、Hep3B、SMMC7721和人胚肝细胞L02中Mcl-1基因的表达,Western Blot方法分别检测不同人肝癌细胞株HepG2、Hep3B和人胚肝细胞株L02中Mcl-1和p53蛋白的表达。分别将靶向Mcl-1的shRNA、野生型p53表达质粒和Mcl-1表达质粒转染HepG2细胞（野生型p53+/Mcl-1+）、Hep3B细胞（野生型p53-/Mcl-1+）和L02细胞（野生型p53+/Mcl-1-）,检测Mcl-1和p53的变化,初步探讨两者之间的关系。结果酶切法证明,所设计、合成的shRNA片段成功插入到psiRNA-Hhneo质粒中,进一步质粒DNA测序证实,所插入片段的DNA片段碱基序列与设计序列完全一致,表明重组质粒构建成功。3个重组质粒成功转染HepG2细胞后,均不同程度下调了Mcl-1基因mRNA和蛋白的表达。其中以1号重组质粒抑制效应最强,shRNA作用48小时后,对HepG2细胞中Mcl-1mRNA的抑制率为93.7%,对Mcl-1蛋白的抑制率为86.4%。PI3K/Akt抑制剂LY294002可明显抑制HepG2细胞中Mcl-1的表达。MTT检测显示Mcl-1表达下调后,HepG2细胞生长受到抑制,凋亡明显增加,转染48小时后存活细胞数仅为空白对照组的53.7%,凋亡细胞百分率为15.6%（对照组为2.9%）;而联合应用MMC或LY294002后,细胞存活率仅为空白对照组的32.2%或13.0%,细胞凋亡率为38.8%或39.7%,显著高于单用MMC或LY294002组。30例原发性肝癌组织标本中,有10例为Mcl-1强表达,11例为弱表达,总阳性表达率为70%,而p53表达阳性率为19/30（63.3%）,两者均为阳性者为17例,Mcl-1和p53表达有明显相关性（r=0.558,p=0.001）。Mcl-1在HepG2细胞和Hep3B细胞中高表达,在SMMC7721细胞中低表达,而在L02细胞中无表达。然而,当HepG2细胞Mcl-1表达下调后,对其p53表达并无影响,同样的,当L02细胞转染表达Mcl-1的质粒后,p53表达无明显变化,Hep3B细胞转染野生型p53质粒后,Mcl-1的表达亦无明显变化。结论1、本研究成功构建了携带以Mcl-1为靶向的shRNA的重组质粒,其对肝癌细胞内Mcl-1的mRNA及蛋白表达具有显著抑制效应。通过RNA干扰技术抑制Mcl-1基因的表达,可诱导HepG2细胞的凋亡增加。2、PI3K/Akt抑制剂LY294002可抑制HepG2细胞中Mcl-1的表达,提示HepG2细胞中Mcl-1的表达可能与PI3K/Akt通路有关。3、当Mcl-1表达下调后,联合化疗药物MMC或PI3K/Akt抑制剂LY294002,可明显抑制HepG2细胞的增殖,促进HepG2细胞凋亡,提示下调Mcl-1后可增强化疗药物的敏感性。4、原发性肝癌细胞组织中,Mcl-1和p53表达均升高,显著高于癌旁组织,并且两者之间的表达有相关性。不同人肝癌细胞中Mcl-1表达升高,而在人胚肝细胞中无表达。但在细胞的实验中表明,Mcl-1与p53之间的相互关系可能并不是通过量的变化来影响的,它们之间具体作用方式及相互关系尚需进一步研究。

论文目录

• 中文摘要
• 引言
• 第一部分 靶向Mcl-1的shRNA重组质粒的构建及其对HepG2细胞增殖和凋亡的影响
• 中文摘要
• 英文摘要
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 联合应用Mcl-1的shRNA重组质粒增强人肝癌细胞HepG2化疗敏感性研究
• 中文摘要
• 英文摘要
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 Mcl-1在原发性肝细胞癌中的表达及其与p53的关系
• 中文摘要
• 英文摘要
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 综述1
• 综述2
• 致谢