同种异体骨髓间充质干细胞联合生长因子移植治疗心肌梗死的实验研究

论文摘要

目的传统观念认为心肌是终末分化组织,梗死后由瘢痕组织修复,为保持心脏的泵血功能,进而发生退行性左室重塑,心功能下降,最终会导致心力衰竭。骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）拥有多向分化的潜能,在心脏的微环境中可以分化为心肌样细胞并表现其功能表现型,利用其移植替代坏死心肌阻止心脏衰竭的恶化进程甚至修复受损心肌已成为目前心肌梗死治疗领域的研究热点。生长因子在细胞的移行,存活以及分化中具有重要作用,局部微环境中应用生长因子可以提高移植细胞的存活和功能,然而其效果并未得到明确证实。因此本研究在BMSCs与心肌细胞共同培养同时联合应用肝细胞生长因子（Hepatocyte Growth Factor,HGF）和胰岛素样生长因子（insulin-like growthfactor-1,IGF-1）,运用激光捕获分化的间充质干细胞,通过检测其心脏转录因子GATA-4的表达研究生长因子在干细胞分化过程中的重要作用。同时通过联合干细胞移植观察其对于梗死后心肌的细胞治疗作用。方法1、骨髓间充质干细胞与心肌细胞共同培养取健康成年兔（5个月左右,体重2.0-2.5kg,中国医科大学动物实验中心）,于无菌条件下抽取兔股骨骨髓2-3mL,于37℃,5%CO2培养箱静置培养。2天后BMSCs黏附于培养瓶底,血细胞等悬浮于培养液中,每3～4d换液一次,4次后非贴壁细胞全部弃净。心肌细胞取自新生兔（1-3天）心室,采用胰酶连续消化法分离细胞后,置于37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。以后每2d换液1次。BMSCs与心肌细胞按1∶1比例混合进行共同培养,实验组加入150ng/ml HGF和200 ng/ml IGF-1,对照组不加。2、心肌梗死模型的建立及细胞移植取28只健康成年兔（中国医科大学动物实验中心）,体重2.0-2.5kg,随机分为4组,每组7只,分别为:联合应用治疗组,单纯干细胞治疗组,生长因子治疗组,安慰剂组为对照组。3%戊巴比妥钠（30mg/kg）经耳缘静脉麻醉,于胸骨左缘Ⅲ,Ⅳ肋间开胸,充分暴露心脏。用眼科小圆针（5-0线）在冠状动脉左室支主干第1,2对角支之间闭塞血管1小时后再灌注。心电图Ⅱ导联上出现S-T段弓背样抬高标志建立缺血再灌注心肌梗死模型成功。MI术后3天,再次按原切口打开胸腔,暴露心脏,选取心肌瘢痕周边及中央共4个注射点,以微量注射器（10 ul）注射骨髓间充质干细胞及生长因子。联合应用治疗组（MSCs+GF）n1=7,给予MSC和生长因子HGF,IGF-1:混有MSCs 40ul（5×106/10ul）,8ul DMEM（150ng/mlHGF、200ng/ml IGF-1）。单纯干细胞治疗组（MSCs）n2=7:单独给予MSC（MSCs40ul）。生长因子治疗组（GF）n3=7,单独给予生长因子HGF,IGF-1:8ul DMEM（150ng/ml HGF、200ng/ml IGF-1）。对照组n4=7给予相同剂量DMEM培养液。3、免疫化学染色体外行细胞共培养后,取培养后的细胞爬片,PBS清洗后,%4多聚甲醛固定30min,PBS洗5min×3,10%牛血清室温封闭20min,吸出血清,加入兔抗-α-肌动蛋白单克隆抗体,PBS清洗后,二抗应用山羊抗兔IgG抗体。经DAB试剂盒显色,苏木素复染。细胞移植治疗各组在心肌梗死后6周采集心脏标本,行免疫荧光染色确定移植骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化。一抗加入兔抗connexin 43单克隆抗体,4℃过夜。二抗应用FITC（绿色荧光）—羊抗兔IgG抗体标记结合。荧光显微镜下观察DAPI+绿色激发光。4、透射电镜技术培养的细胞经缓冲液洗涤后于EP管内固定,乙醇梯度脱水,环氧树脂包埋,ULTRACUT E型超薄切片机切片,经醋酸铀、柠檬酸铅双染色后,Hitachi H-600-4透射电镜观察拍照。5、激光显微切割系统捕获BMSCsBMSCs与心肌细胞共同培养1天,3天,1周,2周,直到6周。实验组及对照组细胞通过免疫细胞化学染色进行肌纤维和核的双染色。兔抗-α-肌动蛋白单克隆体和山羊抗兔过氧化物酶结合的IgG抗体用来标记肌纤维,苏木素复染标记细胞核。选取表达α肌动蛋白阳性并同时存在核分裂的细胞为由BMSCs分化来的心肌样细胞,运用激光显微切割系统（Arcturus）进行捕获,每组捕获大约500个细胞。6、RNA的提取和反转录聚合酶链反应使用PicoPureRNA分离试剂盒对捕获的干细胞提取RNA。逆转录合成cDNA。模板cDNA由Taq HS DNA多聚酶（0.1μl）在含有兔GATA-4的上下游引物（0.2μl）中进行扩增。引物序列如下:兔GATA-4,188bp,上游引物5′-GCCCCTCATcAAGCCTCAG-3′;下游引物5′-TCCCCTCTTTCCGCATCG-3′。β-actin,315bp,上游引物5′-TTCCAGCCCTCCTTCCTG-3′;下游引物5′-GCCCGACTCGTCATACTCC-3′。PCR反应体系45个循环,每一个循环包括变性94℃40s,退火60℃40s,延伸72℃60s,45个循环后最后延伸72℃5min;以β-actin为内参。凝胶图像分析系统扫描扩增产物电泳条带的密度,计算产物的相对量。7、时实三维测定心功能采用PHILIP公司IE33型超声仪,三维探头X-3获取左室三维容积图像。运用仪器自带的QLAB分析软件进行图象切割及分析。在干细胞移植及生长因子注射后6周对4组模型分别进行三维测定。获取左室收缩舒张末期容积参数,测算每搏输出量及射血分数（EF）。结果1、骨髓间充质干细胞和心肌细胞体外培养形态学变化原代培养过程中,骨髓间充质干细胞贴壁生长,贴壁后其形态各异,1周后贴壁细胞逐渐成细胞集落,其形态相对均一,为纺锤形、梭形的成纤维细胞形态,也有少量呈宽大多边形,生长的细胞集落不断增大,2周后达到80%-90%融合（图1）。心肌细胞倒置显微镜下可见传代细胞未贴壁呈圆形,贴壁后,生长逐渐呈多角形,细胞大小均匀,24小时后单个细胞自行蠕动,细胞有伪足伸出并互相连接,生长成片后呈岛屿状搏动,频率30～60次/min。2、BMSCs向心肌细胞转分化由BMSC衍生的心肌样细胞具有心肌细胞的免疫染色特征并在电镜下显示心肌细胞样超微结构。所有的心肌细胞免疫染色显示α-肌动蛋白阳性和连接蛋白43阳性,电镜下细胞核呈均质位于中央无核分裂,而分化为心肌样细胞的BMSCs呈现心肌细胞样超微结构,同时这些细胞的胞核中仍有多个核仁。单纯BMSCs的α-肌动蛋白免疫染色为阴性,将BMSCs与心肌细胞按1∶1比例共同培养诱导其分化,一些BMSCs分化为心肌样细胞,分化的BMSCs一个胞核中存在核分裂,同时其α-肌动蛋白免疫染色为阳性。另外,在被DAPI标记的干细胞注射到心肌组织后也表达连接蛋白43阳性,说明这些心肌样细胞是由BMSCs分化而来。3、转录因子GATA-4的表达心脏转录因子GATA-4通过调控心脏特有基因的表达来支配复杂的心脏生理过程。天然的心肌细胞表达心脏转录因子GATA-4,而单纯BMSCs不表达。将BMSCs与心肌细胞共同培养后,一些BMSCs便可以表达心脏转录因子GATA-4。同时联合应用肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子可以增加间充质干细胞GATA-4的表达。这一结果说明了从BMSCs分化而来的心肌样细胞可以表达心脏转录因子GATA-4即在心脏基因调控上拥有心肌细胞的功能,同时HGF和IGF-1的联合应用在这一过程中发挥了重要作用。与对照组相比,实验组在BMSCs与心肌细胞共培养中联合应用肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子可以极大的增加分化的间充质干细胞的GATA-4的表达。给予生长因子后捕获的间充质干细胞表达的GATA-4从第一天开始增强,在2周时达到高峰,以后维持在高水平。4、三维超声测定心功能结果表1描述了心肌梗死6周后各组心功能变化情况:两组细胞移植治疗组6周时EF值较对照组6周时EF值均有显著提高[（59.4100±2.86033）比（34.4029±1.93404）%,P＜0.05与（56.19864±4.21007）比（34.4029±1.93404）%,P＜0.05];且与单纯给予生长因子组相比,2组治疗组EF值同样有明显改善[（59.4100±2.86033）比（39.8386±5.91513）%,P＜0.05与（56.1986±4.21007）比（39.8386±5.91513）%,P＜0.05]。说明单纯干细胞移植与联合生长因子应用都能有效改善心肌梗死后心功能。但联合应用生长因子后与单纯干细胞移植相比,两组治疗组之间EF值无统计学差异,提示联合应用生长因子提高干细胞的治疗效果并未能在整体心功能的改善上表现出来。结论骨髓间充质干细胞与心肌细胞共同培养后可以分化成心肌样细胞,并表达心脏转录因子GATA-4。联合应用肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子可以促进干细胞向心肌细胞分化,提高GATA-4的表达。单纯干细胞移植与联合生长因子应用都能有效改善心肌梗死后左室收缩功能,减轻室腔扩大,提高心功能。然而联合应用生长因子较单纯干细胞移植对于心肌梗死后心功能的恢复并未出现更好的治疗的效果。提示生长因子对于干细胞的转分化作用在细胞因子水平有明确效果,但在整体心功能的表现上仍有待研究。因此不能否认:生长因子的应用在未来干细胞治疗中仍拥有极大的潜力。

论文目录

• 一、摘要
• 中文论著摘要
• 英文论著摘要
• 二、英文缩略语
• 三、论文
• 论文一、骨髓间充质干细胞与心肌细胞共同培养及分化研究
• 前言
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 论文二、联合应用肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子提高骨髓间充质干细胞GATA-4的表达
• 前言
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 论文三、同种异体骨髓间充质干细胞单独及联合生长因子移植对缺血心肌心功能的影响
• 前言
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 四、本研究创新性的自我评价
• 五、参考文献
• 六、附录
• 综述
• 在学期间科研成绩
• 致谢
• 个人简介