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表达PRV-vp4基因的重组杆状病毒和重组伪狂犬病毒的构建

2020-11-23阅读(339)

表达PRV-vp4基因的重组杆状病毒和重组伪狂犬病毒的构建

论文摘要

猪轮状病毒（Porcine Rotavirus, PRV）属于呼肠病毒科轮状病毒属,是引起仔猪病毒性腹泻的主要病原之一,1-4周龄仔猪的发病率超过80%,死亡率可达20%,该病在世界范围内分布,其感染引发的腹泻已发展成为一种世界性的疾病,给各国的畜牧业造成了严重的危害,有效的疫苗接种是目前预防该病的唯一途径,而现有疫苗存在着易发生毒力回复、异型间免疫效果差的缺憾。伪狂犬病毒（Pseudorabies Virus, PrV）属于疱疹病毒甲亚科水痘病毒属,病毒在猪群中的传播引起妊娠母猪流产、死胎等繁殖障碍及呼吸系统疾病,有传播速度快、传播途径多、流行范围广、致死率高的特点,给养猪业造成了巨大损失,在伪狂犬病的防控中广泛使用的Bartha-K61株等弱毒疫苗被证明是疫苗研制成功的典范,目前研究热点正转为利用生物技术研制重组伪狂犬病毒活载体疫苗方面。本研究中,首先进行了PRV/JL94株的细胞培养和超离纯化,并提取病毒核酸进行研究。根据学者们的观点:vp4基因对轮状病毒的致病力起着关键性的作用;VP4还是重要的中和性抗原,能够刺激机体产生中和抗体,对机体有免疫保护作用;一个VP4血清型别可能包含几个VP7型别,因此选定vp4基因片段研发疫苗,能减少不同型别间免疫效果差的问题,对疾病的防控更有现实意义。学者们认为,vp4基因5’端长750bp的特异性片段主要决定其生物特性,是vp4的主要抗原功能结构区。所以,本研究根据JL94/vp4全基因序列,通过RT-PCR技术克隆其5’端1-756bp（包括全部的VP8区、胰酶区和VP5的N端）,命名为vp4主要抗原位点基因（vp4 Major Antigen Site Gene, vp4-MASG）并进行序列分析,结果表明vp4-MASG基因片段与国外分离株CRW-8株、Gottfried株同一基因片段氨基酸同源性分别是96.43%和67%。同型之间高度保守,不同型间差别较大,其中aa81-207变异性最大。将vp4-MASG同载体pMel BacA连接,与Linear AcMAPV/DNA共转染昆虫细胞Sf9,通过3代蚀斑纯化,筛选出含有vp4-MASG基因的重组杆状病毒并表达出目的蛋白,光密度扫描分析证实所表达蛋白占细胞总蛋白的26%;Western Blotting显示所表达的蛋白有较好的免疫反应性;经纯化的表达蛋白免疫小鼠所得血清能阻止PRV在MA104细胞上形成的细胞病变,说明表达蛋白有免疫原性。构建的表达PRV/vp4基因的重组杆状病毒可以作为亚单位疫苗侯选株,它不含有轮状病毒核酸,不存在毒力回复问题,高安全性和高表达量是其最大特点。轮状病毒性腹泻和伪狂犬病是危害养猪业的两大重要传染病,是否可以利用成功的伪狂犬病毒疫苗株作为活载体表达轮状病毒基因,力争同时防治这两种疾病呢。实验中,将vp4-MASG插入到本课题组构建的gG伪狂犬病毒转移载体多克隆位点上,该转移载体以伪狂犬病毒非必需基因的部分序列作为同源臂,在其间插入gG Promoter、多克隆位点、PolyA、CMV Promoter及其控制的LacZ基因,构建出含有目的基因vp4-MASG和报告基因LacZ的转移载体vp4-MASG-gG;将其与PrV弱毒疫苗株Bartha-K61株（gE?/gI?）病毒基因组DNA,通过脂质体法共转染Vero细胞,经显微镜下挑斑技术的筛选纯化及PCR鉴定,获得了一株表达目的基因的重组伪狂犬病毒,命名为vp4-MASG-PrV;生长动力学实验显示重组病毒

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 1 引言
  • 1.1 轮状病毒研究进展
  • 1.1.1 轮状病毒粒子的形态结构
  • 1.1.2 轮状病毒的表面抗原与分型
  • 1.1.3 轮状病毒的基因组结构特征
  • 1.1.4 轮状病毒蛋白质及其功能
  • 1.1.5 轮状病毒vp4 基因研究进展
  • 1.1.6 轮状病毒疫苗研究进展
  • 1.2 伪狂犬病毒研究进展
  • 1.2.1 伪狂犬病毒分子生物学特性
  • 1.2.2 伪狂犬病毒糖蛋白及其功能
  • 1.2.3 伪狂犬病毒主要毒力基因
  • 1.2.4 伪狂犬病毒疫苗研发
  • 1.3 本课题研究的目的和意义
  • 2 材料与方法
  • 2.1 毒株、细胞、载体和实验动物
  • 2.2 酶类、主要生化试剂及抗体
  • 2.3 引物
  • 2.4 主要实验仪器与设备
  • 2.5 猪轮状病毒JL94 株的增殖及电镜观察
  • 2.5.1 JL94 株病毒的增殖
  • 2.5.2 JL94 株病毒的超离纯化与电镜观察
  • 2.6 vp4 主要抗原位点基因的扩增与序列分析
  • 2.6.1 JL94 病毒核酸的提取及反转录生成模板cDNA
  • 2.6.2 vp4 主要抗原位点基因的扩增与产物纯化
  • 2.6.3 vp4 主要抗原位点基因与pMD18-T 载体的连接与鉴定
  • 2.6.4 vp4 主要抗原位点基因的序列分析
  • 2.7 JL94/vp4-MASG 在在昆虫细胞中的表达
  • 2.7.1 重组质粒vp4-MASG-pMel BacA 的构建
  • 2.7.2 转染用重组质粒vp4-MASG-pMel BacA 的提取与纯化
  • 2.7.3 JL94/vp4-MASG-pMel BacA 与杆状病毒共转染
  • 2.7.4 重组杆状病毒的蚀斑筛选
  • 2.7.5 重组杆状病毒的PCR 鉴定
  • 2.7.6 JL94/vp4-MASG 在昆虫细胞中的表达
  • 2.7.7 Western Blotting 实验
  • 2.7.8 病毒中和实验
  • 2.8 表达PRV/vp4-MASG 的重组伪狂犬病毒构建
  • 2.8.1 JL94/vp4-MASG-gG 重组转移载体质粒的提取与纯化
  • 2.8.2 Bartha-K61 株伪狂犬病毒核酸的提取
  • 2.8.3 vp4-MASG-gG 与Bartha-K61 株病毒核酸共转染
  • 2.8.4 重组病毒vp4-MASG-PrV 的蚀斑筛选和纯化
  • 2.8.5 重组病毒vp4-MASG-PrV 的PCR 筛选与鉴定
  • 2.8.6 重组病毒生长动力学
  • 2.8.7 重组病毒表达动力学实验和Western blotting 实验
  • 2.8.8 间接免疫荧光实验
  • 2.8.9 毒种短期保存期实验
  • 2.8.10 间接ELISA 实验
  • 3 实验结果
  • 3.1 猪轮状病毒JL94 株的增殖与电镜观察结果
  • 3.1.1 JL94 株病毒引起的MA104 细胞病变结果
  • 3.1.2 JL94 株病毒的电镜观察结果
  • 3.2 vp4 主要抗原位点基因的PCR 扩增与序列分析结果
  • 3.3 JL94/vp4-MASG 在在昆虫细胞中的表达结果
  • 3.3.1 重组质粒vp4-MASG-pMel BacA 的鉴定结果
  • 3.3.2 JL94/vp4-MASG-pMel BacA 和杆状病毒共转染结果
  • 3.3.3 重组病毒的蚀斑筛选结果
  • 3.3.4 JL94 株vp4-MASG 在昆虫细胞中表达产物的检测结果
  • 3.3.5 vp4-MASG 在Sf9 细胞中表达产物的Western Blotting 检测结果
  • 3.3.6 病毒中和实验结果
  • 3.4 表达PRV/vp4-MASG 的重组伪狂犬病毒构建结果
  • 3.4.1 JL94/vp4-MASG-gG 重组转移载体质粒的提取与纯化结果
  • 3.4.2 重组病毒vp4-MASG-PrV 的蚀斑筛选和纯化结果
  • 3.4.3 重组病毒vp4-MASG-PrV 的PCR 筛选与鉴定结果
  • 3.4.4 重组病毒生长动力学实验结果
  • 3.4.5 重组病毒表达动力学结果
  • 3.4.6 Western blotting 结果
  • 3.4.7 间接免疫荧光实验结果
  • 3.4.8 毒种短期保存期实验结果
  • 3.4.9 间接ELISA 实验结果
  • 4 讨论
  • 4.1 选择PRV/vp4-MASG 基因用于研发疫苗的立足点
  • 4.2 构建高安全性重组杆状病毒亚单位疫苗株的策略
  • 4.3 重组伪狂犬病毒活载体疫苗的设计
  • 4.3.1 研发重组活载体疫苗的出发点
  • 4.3.2 设计重组活载体疫苗的思路
  • 4.3.3 镜下挑斑技术在筛选重组病毒的中的尝试
  • 4.3.4 vp4-MASG 在重组伪狂犬病毒中表达特性的探讨
  • 4.3.5 重组伪狂犬病毒作为侯选疫苗株的评价
  • 5 结论
  • 致谢
  • 参考文献
  • 攻读学位期间发表的学术论文
  • Curriculum Vitae

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