论文摘要
硒作为生命体中必需的微量元素,是体内各种含硒蛋白或亚单位的活性中心,参与了众多生命活动,对人体、动物和植物的健康生长均起了非常重要的作用。纳米硒是一种具有生物活性的红色单质硒,相对于其他形式硒,具有高生物活性、高安全性、高免疫调节能力、高抗氧化性和低毒性等“四高一低”的优点,由我国科学家首先进行了研制,并在保健品、动物饲料及植物调节剂等领域均得到了广泛应用。高效简便的生物分析与检测技术在研究生物活动本质中发挥着重要作用,例如目前广泛使用的流式细胞术和荧光标记技术提高了生物分析的直观效果,为研究药物药理和细胞活动提供了大量可靠而有力的证据。所以,根据具体研究要求而不断改进与建立新的生物检测技术依然是生物分析领域的重要研究内容。为此,我们采用离体细胞体系开展了电化学分析方法研究,研制了新型生物传感器并应用在细胞生物分析中,为快速、准确地筛选药物和检测细胞活性提供新的选择。本研究主要开展了三方面的工作,首先是对硒纳米颗粒的制备方法进行改进,成功制备了性质稳定的硒纳米颗粒和壳寡糖-硒纳米颗粒,分别研究了他们的生物活性;其次是基于硒纳米颗粒的良好生物活性,研制了一种含有硒与抗肿瘤药物的新型复合纳米药物制剂;最后以硒纳米颗粒的生物活性为研究对象,建立和发展了两种检测生物活性的新方法。主要结果如下:一、硒纳米颗粒的制备及生物活性分析。在以壳聚糖为模板制备硒纳米颗粒方法的基础上改进,实验以壳寡糖为模板,采用抗坏血酸还原亚硒酸钠,成功制备了性质稳定的红色硒纳米颗粒,该方法省去了醋酸溶解壳聚糖的步骤和避免了残留醋酸的毒害作用。通过透射电镜、红外光谱仪、X射线衍射等手段对制备纳米颗粒进行表征,发现制备的硒纳米颗粒平均粒径32nm,颗粒均匀、分散性好,硒以无定形态物理吸附在壳寡糖表面。将硒纳米颗粒与肝癌细胞共培养,结果发现硒在低浓度下促进了细胞的增殖,高浓度下对癌细胞有很好的抑制作用,硒纳米颗粒的抑癌活性与浓度呈正相关。二、荧光法-噻唑兰法联用检测硒纳米颗粒抗氧化活性。基于羟自由基对荧光染料罗丹明B的猝灭作用,建立了硒纳米颗粒清除羟自由基能力的检测方法,并结合噻唑兰实验对比研究了硒纳米颗粒的抗氧化作用和生物活性。结果表明:建立的检测硒纳米颗粒清除自由基的荧光检测方法简便有效,并成功应用于其它抗氧化剂的清除羟自由基能力的检测;同时,研究证实在一定浓度范围内硒纳米颗粒清除自由基能力与浓度成线性关系。与抗坏血酸和亚硒酸钠比较,纳米硒清除自由基的能力远远强于它们,表明纳米硒具有优越的抗氧化性能。利用荧光法与噻唑兰法结合研究硒纳米颗粒作用细胞生长的效果,验证了其生物活性符合Weinberg原理。三、氟尿嘧啶-壳寡糖/硒纳米微球的研制与抗肿瘤活性分析。通过乙酰基将5-氟尿嘧啶与壳寡糖连接,硒纳米粒子吸附在壳寡糖上的方法首次将硒纳米颗粒与抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶同载在壳寡糖纳米微球中,制备了含有5?氟尿嘧啶和纳米硒的壳寡糖复合纳米微球。该微球平均粒径为433 nm,对5-氟尿嘧啶和硒均有缓释作用。将该微球应用于肿瘤细胞的抑制实验中,发现复合纳米微球中两种活性分子对肿瘤细胞的抑制具有明显的协同作用,说明我们自主创制的新型复合纳米药物制剂增强了5?氟尿嘧啶的抗肿瘤效果。四、硒纳米颗粒抗肿瘤活性检测的生物传感器研制。基于Annexin V蛋白与早期凋亡细胞膜外翻的磷脂酰丝氨酸特异结合的特点,应用层层自组装技术将Annexin V蛋白修饰在金电极表面,成功研制了用于检测早期凋亡细胞的生物传感器。通过应用到自建的早期凋亡细胞模型的研究,发现该传感器对早期凋亡细胞具有特异性识别,识别前后的电化学阻抗信号具有明显变化,在37℃、5mM Ca2+浓度下与细胞共孵育1h,可线性检测早期凋亡细胞。该新型传感器的检测效果得到了目前常用的流式细胞仪和荧光显微镜的研究结果验证。将该传感器成功应用于了硒纳米颗粒和氟尿嘧啶诱导的早期凋亡细胞的检测,说明Annexin V修饰生物传感器可用于硒纳米颗粒等生物活性物质的抗肿瘤活性研究,为大量筛选新的生物活性物质提供简便的分析方法。五、壳寡糖-硒纳米植物营养调节剂的研制与应用。通过改进硒化壳寡糖的制备方法,制备了新型的壳寡糖-硒纳米颗粒。通过透射电镜、粒径分析仪等方法表征,发现壳寡糖-硒纳米颗粒平均粒径为100nm左右,在酸性条件下,亚硒酸根与壳寡糖单元上活性羟基和氨基化合,形成壳寡糖-硒复合分子,剩余的基团与带负电的多聚磷酸钠复凝聚,在4℃下能够稳定保存,25℃以上壳寡糖溶胀而致纳米颗粒发生分解。此外,我们以壳寡糖硒纳米颗粒为主要原料研制了植物营养调节剂,考察了壳寡糖硒纳米颗粒对水稻生长和籽粒富硒的情况。结果发现该植物营养调节剂能促进水稻的生长,显著提高大米中抗氧化性物质的总抗氧化能力,通过调控措施可以控制大米中硒含量在0.25mg/kg左右,从而得到了营养品质优于普通大米的富硒大米。
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