东亚钳蝎抗神经兴奋肽表达、纯化及部分性质

论文题目: 东亚钳蝎抗神经兴奋肽表达、纯化及部分性质

论文类型: 硕士论文

论文专业: 微生物与生化药学

作者: 惠长野

导师: 张景海

关键词: 抗神经兴奋肽,分离纯化,表达条件优化

文献来源: 沈阳药科大学

发表年度: 2005

论文摘要: 对东亚钳蝎抗神经兴奋肽(ANEP)同源性分析表明：ANEP与蝎昆虫抑制性神经毒素高度同源，ANEP应属于这一家庭，它们都作用于钠离子通道，是钠离子通道抑制剂。蛋白质同源建模软件WHAT—IF对ANEP三维结构及二硫键进行预测，ANEP空间结构与大部分长链蝎神经毒素相似，二硫键的配对高度保守，由一段a螺旋和三段反平行的β片层构成一个紧密的结构核心，三段反平行的β片层形成一个强疏水面，而C端为无规则卷曲，肽链相对比较延伸。ANEP在大肠杆菌内单独表达二硫键不能形成，多肽以包涵体形式存在于胞浆，将编码序列插入pSYPU-1b，营造胞质氧化环境，该多肽得到了高效可溶性表达。利用His tag对重组多肽进行一步镍柱亲合层析，在非变性、变性条件下，通过改变pH及氯化铵等洗脱条件，可得到电泳纯样品。结合多肽空间结构考察了纯化标签在肽链不同末端的纯化效果，表明空间结构对His tag的屏蔽效应显著影响纯化结果，ANEP在C端融合His tag纯化效果最佳，通过优化纯化条件，ANEP一步镍柱可达到电泳纯，每升发酵液可得目的多肽3mg，而N端融合时收率为0.8mg／L。对于用IPTG、乳糖诱导的由T7 lacUV5启动子控制的重组目的产物的表达规律进行了研究。借助SDS-PAGE分析目的多肽表达量并结合菌体生长状况，比较了诱导的起始阶段、所需的诱导物浓度、诱导持续时间等参数对重组产物表达的影响，确立了两种诱导剂的最佳发酵条件。并考察了葡萄糖抑制效应对乳糖诱导作用的影响，葡萄糖抑制效应对本实验所用质粒影响非常显著，只有在对数生长中后期加入乳糖才可以看到目的蛋白的微量表达，而IPTG的诱导效果不受葡萄糖影响。考察本实验重组质粒稳定性表明，该质粒稳定性较好，重组菌较空宿主菌相比并无生长劣势，培养重组菌每12小时转接一次，在有抗性选择性压力情况下，转接20次质粒突变率为0.317‰，多次传代后蛋白表达量并没有明显变化，满足大规模发酵用重组质粒要求。

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中文摘要

Abstract

前言

第一章蝎抗神经兴奋肽编码基因分析及可溶性表达

1. 实验材料

2. 实验方法

3. 实验结果

3.1 ANEP生物信息学分析

3.2 表达质粒pSYPU-1b-ANEP Ⅱ、Ⅲ的构建

3.3 ANEP在大肠杆菌中表达的可溶性分析

4. 小结

5. 讨论

第二章重组蝎抗神经兴奋肽的分离纯化

1. 实验材料

2. 实验方法

3. 实验结果

3.1 纯化标签 N端融合不同条件下镍柱层析行为

3.2 纯化标签 C端融合不同条件下镍柱层析行为

3.3 柱上变复性条件的确立

3.4 ANEPⅢ的精细纯化

3.5 ANEP最佳纯化方案

4. 小结

5. 讨论

第三章 pSYPU-1b-ANEPⅢ高效表达及质粒稳定性研究

1. 实验材料

2. 实验方法

3. 实验结果

3.1 单因子考察实验结果

3.2 葡萄糖抑制对乳糖诱导效果的影响

3.3 pSYPU-1b-ANEPⅢ质粒稳定性考察

4. 小结

5. 讨论

全文结论

参考文献

致谢

发布时间: 2006-11-27

参考文献

[1].东亚钳蝎抗神经兴奋肽Ⅱ的表达条件优化及纯化条件研究[D]. 周宁.沈阳药科大学2005
[2].转基因烟草表达东亚钳蝎抗神经兴奋肽Ⅱ[D]. 盛钰.沈阳药科大学2006
[3].东亚钳蝎部分毒素基因组基因多序列比对分析[D]. 袁树荣.沈阳药科大学2007
[4].东亚钳蝎毒镇痛活性肽Ⅴ（SAPⅤ）的分离纯化及部分性质研究[D]. 汪丽.沈阳药科大学2006
[5].钳蝎镇痛活性肽（AS）表达产物的体外变复性[D]. 孙巍.沈阳药科大学2006

东亚钳蝎抗神经兴奋肽表达、纯化及部分性质

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