家蚕膜蛋白BmOcular alb的表达与纯化研究

论文摘要

Ocularalb超家族蛋白属于G蛋白偶联受体（GPCR）类似蛋白,是一类可以与异三聚体G蛋白结合的膜蛋白,但与典型的GPCR不同的是Ocularalb超家族蛋白一般不存在于细胞膜而是存在于胞内细胞器（主要是黑色素小体和溶酶体）质膜,该家族在人体及小鼠体内与眼白化病的产生相关,但在其他物种内的具体作用机制不详。从家蚕cDNA文库中,选取一个编码具有Ocularalb超家族蛋白保守序列的基因,命名为BmOcularalb （BmOA）。该基因在GenBank登录号为：DY230641。BmOcularalb蛋白由453 bp核苷酸序列编码的150个氨基酸残基组成,经生物信息学分析,该蛋白含有两个跨膜区,分子量为17.7 kD,等电点为9.94。将BmOA基因克隆到pBacPAK8-Ph-tev （Ph为多角体基因,编码29 kD大小的蛋白,tev为TEV酶切位点编码基因）质粒中,获得重组质粒pBacPAK8-Ph-tev-BmOA,经 BamH I和Not I双酶切后,将Ph-tev-BmOA插入原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒,并转化感受态大肠杆菌BL21（DE3）。转化工程菌后以IPTG诱导表达后经SDS-PAGE分析及Western blotting检测,确定了融合蛋白Ph-tev-BmOA的表达。由于含有多角体的融合蛋白与天然多角体具有相同的特性,利用多角体的特性纯化该融合蛋白,通过简单的纯化方法（反复调节pH值）达到纯化融合蛋白的目的。同时,成功的构建了重组h-tev-BmOA质粒,通过Bac-to-Bac系统,成功构建了重组杆状病毒　Bacmid-Ph-tev-BmOA;重组杆状病毒基因组通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞,获得了表达多角体融合蛋白的发病细胞,并在发病细胞中发现融合蛋白表达。为了分析BmOA基因的功能,进一步研究BmOA蛋白在家蚕中的作用,我们进行了荧光定量PCR,发现该基因在家蚕五龄幼虫的气门中的转录量最高。我们通过RNAi实验初步探索了,BmOA在家蚕细胞中对于细胞周期的影响。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语
• 第一部分 文献综述与实验设计
• 第一章 文章综述
• 1 膜蛋白研究
• 1.1 膜蛋白
• 1.2 膜蛋白研究的意义
• 1.3 膜蛋白研究的现状
• 2 Ocular alb超家族
• 2.1 Ocular alb与GPCR
• 2.2 OA1生物学作用
• 2.3 OA1及眼白化病Ⅰ型的研究进展
• 3. 家蚕杆状病毒表达系统及多角体融合表达
• 3.1 家蚕生物反应器
• 3.2 家蚕核型多角体病毒
• 3.3 家蚕Bac-to-Bac表达系统
• 3.4 多角体融合表达的研究及应用
• 第二章 实验设计方案
• 1 实验目的和意义
• 2 研究内容
• 3 实验流程和实验技术
• 第二部分 研究论文
• 第三章 生物信息学分析
• 1 生物信息学工具和软件
• 2 方法
• 3 结果
• 3.1 基因序列的比对
• 3.2 疏水性分析
• 3.3 跨膜分析
• 3.4 信号肽分析
• 3.5 定位分析
• 3.6 高级结构预测
• 3.7 BmOA基因氨基酸序列的同源性分析
• 3.8 BmOA基因进化树的构建
• 4 讨论
• 第四章 原核表达及蛋白纯化
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 主要试剂的配制
• 1.3.1 碱法小量制备质粒用试剂
• 1.3.2 SDS-PAGE电泳用试剂
• 1.3.3 纯化用试剂
• 1.3.4 Bradford检测用试剂
• 1.3.5 Western blotting用试剂
• 2 方法
• 2.1 BmOA基因的克隆
• 2.1.1 PCR获得完整的ORF序列
• 2.1.2 PCR产物与pBacPAK8-Ph-tev质粒的双酶切反应
• 2.1.3 酶切产物的纯化
• 2.1.4 连接反应
• 2.1.5 重组质粒pBacPAK8-Ph-tev-BmOA与表达载体pET-28a的双酶切
• 2.1.6 酶切产物的纯化
• 2.1.7 连接反应
• 2.1.8 CaCl2法制备E.coli TG1、BL21（DE3）感受态细胞
• 2.1.9 连接产物的转化
• 2.1.10 重组克隆的筛选与鉴定
• 2.2 重组质粒的转化及鉴定
• 2.3 重组pET-28a-Ph-tev-BmOA质粒在大肠杆菌中的表达
• 2.4 SDS-PAGE电泳分析
• 2.5 融合蛋白表达产物存在形式的检测分析
• 2.6 融合蛋白以多角体的特性进行纯化
• 2.6.1 重组蛋白的大量表达与样品制备
• 2.6.2 利用pH改变纯化融合蛋白
• 2.6.3 Bradford法检测蛋白浓度
• 2.6.4 Western blotting检测
• 3 结果
• 3.1 PCR扩增目的基因片段
• 3.2 重组质粒pBacPAK8-Ph-tev-BmOA的鉴定
• 3.3 重组质粒pET-28a-Ph-tev-BmOA的鉴定
• 3.4 融合蛋白的诱导表达鉴定
• 3.5 融合蛋白的纯化
• 4 讨论
• 第五章 BmOA和polh基因在家蚕杆状病毒表达系统中的融合表达
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 试剂配制
• 2 方法
• 2.1 pUC/M13引物设计
• 2.2 重组载体pFastBacHTB-Ph-tev-BmOA的构建
• 2.3 连接反应
• 2.4 重组病毒基因组Bacmid-Ph-tev-BmOA的构建
• 2.4.1 BmDH10Bac菌感受态的制备
• 2.4.2 重组质粒的转化
• 2.4.3 重组Bacmid的提取
• 2.4.4 重组Bacmid PCR鉴定
• 2.5 细胞培养与冻存、复苏
• 2.5.1 家蚕细胞BmN贴壁培养
• 2.5.2 细胞冻存
• 2.5.3 细胞复苏
• 2.6 重组病毒vBmPh-tev-BmOA的构建及鉴定
• 2.6.1 重组病毒基因组通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞
• 2.6.2 重组病毒vBmPh-tev-BmOA鉴定
• 2.7 目的蛋白Ph-tev-BmOA在家蚕BmN细胞中的表达
• 3 结果
• 3.1 重组载体pFastBacHTB-Ph-tev-BmOA鉴定结果
• 3.2 重组病毒DNA vBmPh-tev-BmOA鉴定鉴定结果
• 3.3 目的蛋白Ph-tev-BmOA在家蚕BmN细胞中的表达
• 4 讨论
• 第六章 BmOA在五龄家蚕各组织中的表达分布
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 2 方法
• 2.1 总RNA的提取
• 2.2 引物设计
• 2.3 cDNA的合成
• 2.4 荧光定量PCR反应程序
• 2.5 荧光定量PCR数据分析
• 3 结果
• 3.1 荧光定量PCR扩增曲线与熔解曲线
• 3.2 五龄幼虫各组织荧光定量PCR产物电泳检测
• 3.3 家蚕五龄幼虫各组织中BmOA基因的荧光定量PCR数据结果
• 4 讨论
• 第七章 BmOA基因的RNAi对家蚕培养细胞生物活性的影响
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 试剂的配制
• 2 方法
• 2.1 dsRNA的合成
• 2.1.1 合成体外转录模板
• 2.1.2 体外转录RNA
• 2.1.3 dsRNA浓度的测定
• 2.2 RNAi-dsRNA的转染
• 2.3 MTT检测细胞活力
• 2.4 流式细胞仪检测
• 3 结果
• 3.1 dsRNA的合成
• 3.2 BmOA RNAi的MTT检测结果分析
• 3.3 流式细胞仪检测
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢