乙型肝炎病毒X蛋白介导microRNA在原发性肝癌中的机制研究

论文摘要

原发性肝细胞癌（HCC）是世界常见的恶性肿瘤之一,流行病学调查发现数百万HCC患者合并有乙型肝炎病毒（HBV）的感染,而HBV患者发生HCC的几率比非HBV患者高100倍,乙型肝炎病毒（HBV）感染被认为是HCC发生最主要的原因。乙型肝炎病毒x蛋白（HBx）由HBV编码,在HBV相关肝癌的发生、发展、转移中具有重要作用,但由于很少有理想的动物模型来论证HBx在HCC发生发展中的作用,因此HBx在肿瘤发生发展过程中的分子机制并不完全清楚。幸运的是,p21-HBx转基因小鼠已经建立起来,它是通过同源重组和干细胞培养技术将HBx基因插入p21基因的第二外显子区域而建立的转基因动物模型。据报道该模型的p21-/-小鼠在2年以上的时间没有一只小鼠发生肿瘤,提示该模型小鼠的p21缺失不会增加小鼠发生HCC肿瘤的易感性。并且,HBx基因受PGK启动子（强启动子）的调控,因此,HBx蛋白能在该模型中的肝脏持续稳定的表达24个月以上,并且60%的该转基因小鼠在18个月左右能发展HCC,有些甚至发生了肿瘤转移,这现象与人类感染HBV后发展成HCC的病史相似。因此,p21-HBx转基因小鼠为我们研究HBx致HCC发生、发展、转移中可能的机制提供了理想的动物模型。MicroRNAs （miRNAs）是一种大小约21-23个碱基的非编码单链小分子RNA,在生物体内发挥重要作用,包括细胞增殖,凋亡,应激反应和肿瘤发生。最近研究显示miRNA在多种肿瘤中的表达水平发生了变化,可能在某些肿瘤的发生中发挥了重要作用。研究认为miRNA水平的变化常导致其靶基因的表达异常,从而影响了肿瘤的进程。许多肿瘤都涉及到了miRNA的变化,并且其变化程度还与肿瘤的分型分级以及预后密切相关,这提示我们miRNA在肿瘤发生发展中所发挥了重要作用,其表达的模式可作为肿瘤诊断/预后的分子标记。但现在很少有文献系统的研究与HBx特异相关的miRNA在HBx导致的HCC发生、发展、转移中的作用。目前普遍认为HBx是病毒反式作用因子,它通过与宿主的转录因子（如AP-1、AP-2、NF-κB、ATF2、CREB等）结合而发挥其生理功能,这种结合可以发生在宿主DNA的任何区域,从而导致宿主基因的不稳定性,而基因的这种不稳定性如果发生在原癌基因、抑癌基因或者miRNA基因等部位,就会改变这些基因的表达,从而导致肿瘤的发生。这就提示了,虽然目前一些已知的基因和蛋白能提供很多有用的信息,但是对miRNA研究的新发现也能为我们理解HBx致HCC发生、发展、转移机制提供新视角。因此,发现一个或一组与HBx特异相关的miRNA对我们具有重要意义,它能让我们更好的理解HCC的发生发展机制,做到早期诊断,改善治疗干预手段,防止HCC转移和复发,提高肝癌患者的存活率。基于上述发现,展开研究,利用real-time PCR技术对p21-HBx转基因小鼠和野生型小鼠肝脏的miRNA进行了表达水平分析,功能分析,并在HCC患者标本中进行验证,初步探讨了与HBx功能相关的miRNAs在HCC发生发展中的作用。通过实验我们发现,与野生型小鼠相比,转基因小鼠肝脏中有7个miRNA的表达水平发生变化,其中,5个上调的miRNA（miR-212, miR-23a,miR-155,miR-17-5p和miR-20a）,2个下调的miRNA（miR-152和miR-200a）,它们的变化趋势随着肿瘤的发展而表现的更为明显。随后,利用HBx敲入（将pEGFP-HBx转入HepG2细胞）和敲出（用adr HBx干扰HepG2.2.15细胞中HBx的表达）的细胞模型发现,筛选出的这7个特异性miRNA的表达水平与HBx的表达水平密切相关,它们呈剂量依赖关系。体外功能实验证明它们能调节细胞增殖、细胞凋亡和细胞侵袭的潜能,并可能在HCC发生发展中发挥作用:过表达的miR-212,miR-23a,miR-155,miR-17-5p和miR-20a能抑制细胞凋亡,而过表达的miR-152和miR-200a则能促进细胞凋亡;过表达的miR-212,miR-17-5p和miR-20a能促进细胞增殖,而过表达的miR-200a则能抑制细胞增殖;另外,过表达的miR-212,miR-23a,miR-17-5p和miR-20a能显著增强细胞侵袭和迁移的潜能;而过表达的miR-152和miR-200a则明显抑制了细胞侵袭和迁移的潜能,这些miRNAs的表达模式均在HCC患者标本中得以验证。我们的实验结果表明这组miRNA参与了HBx介导的HCC发生发展过程,因此可能是HBV相关HCC的标志物。同时,实验结果显示miR-143在10月龄的转基因小鼠肝脏（正常,未发现病变）中的表达水平明显降低,而在22月龄的转基因小鼠肝脏（发生HCC）中的表达水平明显上升,尤其是那些伴随肺转移的转基因小鼠,上调水平更明显,接着,HBV相关HCC患者标本中miR-143的表达模式也进一步验证了上述结果:miR-143在HBV相关HCC标本中显著上调,尤其是具有转移特点的HBV相关HCC标本中显著上调。体外功能实验发现miR-143并不能影响细胞的增殖和凋亡,却能显著提高细胞的侵袭能力,并且其促进细胞侵袭和迁移的能力是通过HBx调控途径而实现。进一步用软件分析和CHIP实验发现NF-κB可以直接结合到人mir-143基因上游的5kb左右位点,并且直接调控miR-143的表达。随后,利用TargetScan分析软件和荧光素报告酶系统筛选出其下游靶基因为FNDC3B（fibronectin type III domain containing 3B）。体内外实验均证明,受NF-κB调控的miR-143通过下调靶基因FNDC3B,从而参与了由HBx介导的HCC肿瘤转移的过程,这一发现为HBV相关性HCC的肿瘤转移网络补充了一条重要的信号通路——HBx/NF-κB/ miR-143/ FNDC3B。与HBx特异相关的miRNA及其在原发性肝细胞癌中的功能机制研究将为阐明HBV相关性HCC的发生发展分子机制提供许多有意义的新思路,为理解受HBx影响的纷繁复杂的信号通路提供一定的帮助,并为进一步早期诊断HCC,治疗HCC,防止HCC的转移和复发提供靶点。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 引言
• 第一章 在原发性肝细胞癌发生发展中与乙型肝炎病毒 x 蛋白相关的一组 microRNA 的研究
• 一、前言
• 二、材料和方法
• 三、实验结果
• 四、讨论
• 五、参考文献
• 六、小结
• 第二章 受NF-κB调控的microRNA-143 通过下调纤连蛋白促进原发性肝癌的转移
• 一、前言
• 二、材料和方法
• 三、实验结果
• 四、讨论
• 五、参考文献
• 六、小结
• 附录
• 文献综述
• 参考文献
• 在读期间撰写、发表的论文
• 致谢