重组DEV gH与UL24基因杆状病毒构建及gH与UL24蛋白细胞定位

论文摘要

鸭病毒性肠炎（Duck Viral Enteritis，DVE）是由鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus，DEV）引起的鸭、鹅和天鹅等水禽的一种急性、接触传染性的疱疹病毒感染。目前DEV的研究已经进入基因组时代，截至目前至少已克隆出41个完整的DEV ORF。本研究以克隆的DEV gH与UL24基因为出发点，对DEV gn与UL24蛋白的特性进行初步研究。重组DEV gH与UL24基因杆状病毒的构建：根据已发表的DEV gH与UL24基因序列，设计引物p1／p2、p3／p4与p5／p6并以DEV核酸为模板克隆gH（2505bp）与UL24（1230bp）基因。其中将gH基因分为互相重叠的两个片段gH1与gH2，用引物p1／p2扩增gH1基因并将该基因连接pMD18-T载体构建克隆载体pMD18-T-gH1；引物p3／p4扩增gH2基因。用XhoⅠ与SfcⅠ双酶切pMD18-T-gH1，sfcⅠ与KpnⅠ双酶切gH2，最后将这两段酶切产物与pBlueBacHis2A连接，成功构建了重组杆状病毒转移载体pBlue-gH。用p5／p6扩增UL24基因并将该基因连接pMD18-T载体构建克隆载体pMD18-T-UL24，用XhoⅠ与EcoRⅠ双酶切pMD18-T-UL24，将酶切产物与pBlueBacHis2A连接，构建重组杆状病毒转移载体pBlue-UL24。分别将鉴定为阳性的重组质粒纯化，与线性化的杆状病毒共转染Sf9昆虫细胞，经3轮蚀斑筛选，获得了纯化的重组杆状病毒。gH蛋白细胞定位：将gH基因扩增产物连接pMD18-T构建克隆载体pMD18-T-gH，并与真核表达载体pcDNA3.1（+）分别用HindⅢ与EcoRⅠ双酶切，构建重组真核表达载体pcDNA-gH。将纯化的阳性重组质粒用脂质体法转染293细胞，并用该纯化质粒免疫BALB／c鼠以制备抗gH蛋白血清。间接免疫荧光试验表明，实现了DEV gH蛋白在体外的瞬时表达，并发现该蛋白定位于细胞外膜。将转染细胞用Trizol法提取细胞总RNA，gH基因特异性引物进行RT-PCR检测，结果出现目的条带，进一步证明了gH蛋白在体外的表达。UL24蛋白细胞定位：根据已发表的UL24基因序列，设计引物p7／p8以DEV核酸为模板进行扩增。将扩增后的目的基因亚克隆至pEGFP-C1载体中，构建重组表达载体pEGFP-UL24，将鉴定为阳性的重组质粒纯化并用脂质体法转染293细胞。用荧光显微镜观察pEGFP-UL24在体外表达，且观察UL24蛋白定位于细胞核。将转染细胞用Trizol法提取细胞总RNA，UL24基因特异性引物进行RT-PCR检测，结果出现特异性的条带，进一步证明了UL24蛋白在体外的表达。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 鸭肠炎病毒研究进展
• 1.1.1 历史
• 1.1.2 病原学
• 1.1.3 流行病学
• 1.1.4 DEV人工感染鸭体内分布规律
• 1.1.5 分子生物学特性
• 1.1.6 诊断
• 1.1.7 疫苗研制
• 1.2 α疱疹病毒gH与UL24蛋白研究进展
• 1.2.1 α疱疹病毒gH蛋白研究进展
• 1.2.2 α疱疹病毒UL24蛋白研究进展
• 1.3 研究的目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 病毒与细胞
• 2.1.2 鸡胚与实验动物
• 2.1.3 载体
• 2.1.4 生物学试剂
• 2.1.5 引物设计
• 2.1.6 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 DEV目的基因的克隆
• 2.2.2 重组gH与UL24基因杆状病毒的构建
• 2.2.3 gH蛋白细胞定位
• 2.2.4 UL24蛋白细胞定位
• 3 结果
• 3.1 DEV目的基因的克隆
• 3.2 重组质粒pMD18-T-gH1与gH2基因片段的鉴定
• 3.2.1 重组质粒pMD18-T-gH1的鉴定
• 3.2.2 gH2基因片段的鉴定
• 3.3 重组质粒pMD18-T-UL24的鉴定
• 3.4 重组DEV gH与UL24基因杆状病毒的构建
• 3.4.1 重组质粒pBlue-gH的鉴定
• 3.4.2 重组质粒pBlue-UL24的鉴定
• 3.4.3 重组质粒pBlue-gH与pBlue-UL24的纯化
• 3.4.4 昆虫细胞的转染及重组病毒筛选
• 3.4.5 重组病毒的PCR检测
• 3.5 gH蛋白细胞定位
• 3.5.1 重组质粒pMD18-T-gH的鉴定
• 3.5.2 重组质粒pcDNA-gH的鉴定
• 3.5.3 重组质粒pcDNA-gH的纯化
• 3.5.4 重组质粒pcDNA-gH瞬时表达的间接免疫荧光检测
• 3.5.5 重组质粒pcDNA-gH瞬时表达的RT-PCR检测
• 3.6 UL24蛋白细胞定位
• 3.6.1 PCR反应克隆UL24基因
• 3.6.2 重组质粒pMD18-T-UL24的鉴定
• 3.6.3 重组质粒pEGFP-UL24的鉴定
• 3.6.4 重组质粒pEGFP-UL24的纯化
• 3.6.5 重组质粒pEGFP-UL24瞬时表达的荧光检测
• 3.6.6 重组质粒pEGFP-UL24瞬时表达的RT-PCR检测
• 4 讨论
• 4.1 gH基因分段克隆策略
• 4.2 重组DEV gH与UL24基因杆状病毒的构建
• 4.2.1 杆状病毒表达系统的选择
• 4.2.2 重组DEV gH基因杆状病毒
• 4.2.3 重组DEV UL24基因杆状病毒
• 4.3 脂质体转染
• 4.3.1 细胞
• 4.3.2 血清
• 4.3.3 DNA质量
• 4.4 DEV gH蛋白细胞定位
• 4.4.1 pcDNA3.1载体的选择
• 4.4.2 DEV gH蛋白的细胞定位
• 4.5 DEV UL24蛋白细胞定位
• 4.5.1 pEGFP-C1载体的选择
• 4.5.2 DEV UL24蛋白的细胞定位
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士期间发表的学术论文