硫酸乙酰肝素抗人乳腺癌作用的研究

论文摘要

目的：1、探讨正常人乳腺上皮细胞（MCF-10A）合成的硫酸乙酰肝素（heparansulfate,HS）对乳腺癌细胞的抑制作用。2、探讨HS对乳腺癌小鼠移植肿瘤的抑制作用。3、研究在内质网（endoplasmic reticulum, ER）应激状态下，乙酰肝素酶（Heparanase，Hpa）表达的变化。4、研究在内质网应激状态下，HS抗乳腺癌的作用。方法：第一部分细胞实验1、提取MCF-10A细胞汇合期培养液中的HS链；以浓度200、400、800、1600mg.L-1的HS处理乳腺癌MDA-MB-231以及SK-BR-3细胞株24、36、72h后采用MTT比色法，检测增殖抑制率,并根据此实验计算HS的IC50；并采用集落克隆实验检测HS对MDA-MB-231以及SK-BR-3细胞增殖抑制作用。2、2-脱氧葡萄糖（2-deoxyglucose，2-DG）（1.25、2.5、5、10和20mM）以及衣霉素（Tunicamycin, TM）（1.5、3、6、9和12μM）处理乳腺癌细胞株SK-BR-324、48、72h后采用MTT比色法，检测肿瘤细胞的增殖抑制率;同时HS（200、400、800、1600mg.L-1）联合2-DG （10mM）和TM （3μM）作用于乳腺癌细胞株SK-BR-324、48、72h后采用MTT比色法，检测肿瘤细胞的增殖抑制率;并采用集落克隆形成实验检测HS联合2-DG和TM作用于乳腺癌细胞株SK-BR-3的增殖抑制作用。3、以乳腺癌细胞株MDA-MB-231，SK-BR-3为研究对象，用2-DG、TM、HS以及HS联合2-DG和TM作用于细胞不同时间（0、6、12、24、36h），Western blot检测GRP78和Hpa的表达；同上处理,溴化丙啶（propidium iodide, PI）染色流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡率以及采用Hochest33258荧光染色法通过荧光显微镜观察肿瘤细胞的细胞核形态学的变化。4、分别用HS、TM、2-DG以及HS联合2-DG和TM作用于乳腺癌细胞株MDA-MB-231以及SK-BR-3，检测乳腺癌细胞株MDA-MB-231以及SK-BR-3的caspase-3活性。5、分别用HS、TM、2-DG以及HS联合2-DG和TM作用于乳腺癌细胞株，Western blot检测乳腺癌细胞株MDA-MB-231以及SK-BR-3的抗凋亡蛋白BcL-2、BcL-xL和促凋亡蛋白Bax、Bad的表达。第二部分动物实验一、HS对C3H小鼠移植肿瘤的抑制作用1、C3H小鼠乳腺癌为瘤源制成细胞悬液，调细胞浓度为2×107/ml接种于无瘤C3H小鼠,随机分组。第9天起，每组予生理盐水（NS）、HS腹腔注射，每天给药一次，每三天测量肿瘤长短径1次，绘制肿瘤生长曲线，第18天处死小鼠，称量肿瘤体重，计算抑瘤率；并测量脾重指数。2、肿瘤组织做常规石蜡包埋、切片并做HE染色，置于显微镜下观察其病理变化；采用一步法Tunel试剂盒（红色荧光）检测肿瘤组织的凋亡情况。二、HS对人乳腺癌细胞裸鼠的抑制作用1、乳腺癌移植瘤模型的建立SK-BR-3细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液,在5%CO2、37℃条件下培养,待75%-85%细胞融合时,经胰酶消化后离心,用PBS清洗2次,将其吹打成悬浮液细胞浓度最终约为1×107/ml时备用。取SK-BR-3细胞0.2ml（约2×106个）,局部消毒后接种于裸鼠右侧胸壁第二乳垫脂肪层下,建立乳腺癌移植瘤模型。2、动物分组隔日观察裸鼠肿瘤的生长情况,用游标卡尺测量肿瘤的最大直径和其相应的横径,当肿瘤的体积达到300-500mm3时,将其随机分为2组,每组10只,A组为生理盐水组,B组为腹腔注射HS组。每天给药一次，每三天测量肿瘤长短径1次，绘制肿瘤生长曲线，第28天处死小鼠，称量肿瘤体重，计算抑瘤率；并测量脾重指数。3、肿瘤组织做常规石蜡包埋、切片并做HE染色，置于显微镜下观察其病理变化；采用一步法Tunel试剂盒（红色荧光）检测肿瘤组织的凋亡情况。结果：第一部分细胞实验一、HS、2-DG、TM以及HS联合2-DG和TM作用于乳腺癌细胞株MDA-MA-231以及SK-BR-3的增殖抑制作用。1、MTT法显示结果为不同浓度的HS均能抑制乳腺癌细胞株MDA-MB-231以及SK-BR-3的增殖活性，与对照组比较有显著差异（P﹤0.05），且随着HS浓度的增加抑制率随之增大，随着作用时间的延长抑制率也随之增加；浓度为HS1600μg/ml时对肿瘤细胞的抑制作用最强，作用72h后，HS对乳腺癌细胞株MDA-MB-231以及SK-BR-3最大抑制率分别为75.43%和79.59%。并且通过集落克隆形成实验进一步证实了HS在低浓度即可明显抑制乳腺癌细胞株MDA-MB-231以及SK-BR-3的增值作用。2、MTT法结果显示，乳腺癌细胞株SK-BR-3对内质网应激诱导剂2-DG以及TM并不敏感，最高浓度组2-DG20mM以及12μM的TM对乳腺癌细胞的抑制作用最强，作用72h后，2-DG以及TM对乳腺癌细胞株SK-BR-3的最大抑制率仅为25.19%以及30.53%;外源性的加入HS，通过MTT研究发现，TM以及2-DG在诱导乳腺癌细胞株SK-BR-3产生内质网应激状态下，能明显的增强HS对乳腺癌细胞株SK-BR-3的敏感性，HS联合2-DG和TM作用于乳腺癌细胞株SK-BR-372h后，最大抑制率达到了80.21%以及81.40%。并且通过集落克隆形成实验进一步证实了，在内质网应激状态下，HS在低浓度即可明显抑制乳腺癌细胞株MDA-MB-231以及SK-BR-3的增值活性。二、HS诱导乳腺癌细胞株MDA-MB-231以及SK-BR-3的凋亡作用。1、PI染色流式细胞仪检测，HS诱导乳腺癌细胞株MDA-MB-231以及SK-BR-3的凋亡率分别达到25.67%和23.3%，与空白对照组相比，有统计学意义（P<0.05）；2、采用Hochest33258荧光染色法，通过荧光显微镜观察发现，HS能诱导乳腺癌细胞株MDA-MB-231以及SK-BR-3的细胞核浓集而呈亮蓝色,或核呈分叶,碎片状,边集；而在空白对照组中未发现异常形态的核表现,可见细胞核轮廓清晰圆滑,淡蓝色,结构均一。3、通过caspase-3活性试剂盒检测研究发现，HS能诱导乳腺癌细胞株MDA-MB-231以及SK-BR-3的caspase-3活性表达的上调，与空白对照组比较，有显著差异（P<0.01）。4、通过western blot检测发现，与空白对照组相比，HS能诱导乳腺癌细胞株MDA-MB-231以及SK-BR-3的抗凋亡蛋白BcL-2、BcL-xL表达降低，而乳腺癌细胞株MDA-MB-231以及SK-BR-3的促凋亡蛋白Bax、Bad表达增加,差异有显著性（P<0.01）。三、诱导ER应激对乳腺癌细胞株MDA-MB-231以及SK-BR-3的Hpa表达以及凋亡的影响给予经典的ER stress诱导剂TM以及2-DG作用于乳腺癌细胞株MDA-MB-231以及SK-BR-3,可以上调GRP78和Hpa蛋白表达，与空白对照组相比，有显著差异（P<0.01）。PI染色后流式细胞仪进行分析，TM以及2-DG诱导乳腺癌细胞株SK-BR-3在48h时凋亡率达最高分别为16.7%以及15.3%,与对照组0h相比,48h差异有统计学意义（P<0.05）。四、内质网应激诱导剂TM以及2-DG增强HS诱导乳腺癌细胞株SK-BR-3凋亡的作用。1、PI染色流式细胞仪检测，TM以及2-DG诱导乳腺癌细胞株SK-BR-3的凋亡率分别达到16.7%和15.3%;HS联合TM以及2-DG作用于乳腺癌细胞株SK-BR-3的凋亡率分别达到59.85%和58.11%,与HS组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。2、采用Hochest33258荧光染色法，通过荧光显微镜观察发现，在TM和2-DG诱导乳腺癌细胞株SK-BR-3产生内质网应激的状态下，HS诱导乳腺癌细胞核变化更加明显，乳腺癌细胞核浓集而呈亮蓝色,或核呈分叶,碎片状,边集；而在对照组中未发现异常形态的核表现,可见细胞核轮廓清晰圆滑,淡蓝色,结构均一。3、通过caspase-3活性试剂盒检测研究发现， TM以及2-DG在诱导乳腺癌细胞株SK-BR-3产生内质网应激状态下， HS能明显增强乳腺癌细胞株SK-BR-3的caspase-3的表达，与HS组相比，差异有显著性（P<0.01）。4、通过western blot检测发现，TM以及2-DG在诱导乳腺癌细胞株SK-BR-3产生内质网应激状态下，HS能明显的诱导乳腺癌细胞株SK-BR-3的抗凋亡蛋白BcL-2、BcL-xL表达降低，并且HS能明显增加乳腺癌细胞株SK-BR-3的促凋亡蛋白Bax、Bad表达,与HS组相比，差异有显著性（P<0.01）。第二部分动物实验一、HS对C3H小鼠移植肿瘤的抑制作用1、HS对C3H小鼠移植性乳腺癌的生长具有明显的抑制作用，第18天测量移植肿瘤瘤重分别为：NS组（0.967±0.15）g,HS组（0.55±0.14）g。与NS组比较，HS组的肿瘤体积明显减小，抑瘤率达到43.12%，差异具有显著性（P<0.01）；检测C3H小鼠移植肿瘤的脾重指数发现，与NS组比较，HS组的脾重指数有所下降，但无统计学意义。2、HE染色组织病理学检查显示:HS组细胞大小不一，核质深染，可见点状坏死灶及大片的无结构红染坏死表现；NS组的细胞形态呈多形性，大小不一，失去极性，核深染，核浆比例升高。3、一步法Tunel细胞凋亡检测试剂盒（红色荧光）检测肿瘤组织的凋亡情况，通过荧光显微镜观察，HS组的红色荧光明显比NS组强，这是由于细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶（Terminal DeoxynucleotidylTransferase, TdT）的催化下加上红色荧光探针Cy3（Cyanine3）标记的dUTP，从而可以通过荧光显微镜进行检测。二、HS对人乳腺癌细胞裸鼠的抑制作用1、HS对人乳腺癌细胞裸鼠的生长具有明显的抑制作用，第28天测量移植肿瘤瘤重分别为：NS组（5.27±0.37）g,HS组（3.03±0.17）g。与NS组比较，HS组的肿瘤体积明显减小，抑瘤率达到42.55%，差异具有显著性（P<0.01）；检测人乳腺癌细胞裸鼠的脾重指数发现，与NS组比较，HS组的脾重指数有所下降，但无统计学意义。2、HE染色组织病理学检查显示HE染色组织病理学检查显示HS组细胞大小不一，核质深染，可见点状坏死灶及大片的无结构红染坏死表现；NS组的细胞形态呈多形性，大小不一，失去极性，核深染，核浆比例升高。3、一步法Tunel细胞凋亡检测试剂盒（红色荧光）检测肿瘤组织的凋亡情况，通过荧光显微镜观察，HS组的红色荧光强度明显比NS组高。这是由于细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶（Terminal DeoxynucleotidylTransferase, TdT）的催化下加上红色荧光探针Cy3（Cyanine3）标记的dUTP，从而可以通过荧光显微镜进行检测。结论：1、人正常乳腺上皮细胞合成的HS，具有体内外抗乳腺癌作用，其作用机制可能是与caspases家族促凋亡作用以及Bcl-2家族的促凋亡作用有关。2、在内质网应激状态下，HS能调控肝素酶表达。3、在内质网应激状态下，HS诱导乳腺癌细胞株的凋亡增加。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 材料与方法
• 第一部分 HS 体内外抗乳腺癌作用
• 第二部分 内质网应激调控乙酰甘素酶的表达
• 第三部分 内质网应激诱导剂 TM 以及 2-DG 增强 HS 诱导乳腺癌细胞株SK-BR-3 的凋亡作用
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录 A
• 附录 B
• 综述
• 参考文献
• 论著
• 参考文献