PBI121-Lyz-GFP基因表达载体的构建及其对紫花苜蓿愈伤组织的转化

论文摘要

以紫花苜蓿不同品种（“甘农3号”、和田苜蓿、秘鲁苜蓿）为研究对象,进行了抗病基因对紫花苜蓿的转化的研究。筛选出了愈伤组织诱导的最佳培养基及其激素组合;构建了GFP（green fluorescent protein,绿色荧光蛋白）和Lyz （lysozyme,溶菌酶）基因的表达载体PBI121-Lyz-GFP;优化了农杆菌介导的苜蓿基因转化体系;并将抗病基因Lyz基因和报告基因GFP导入和田苜蓿中,对转化的愈伤组织进行了分子检测及荧光检测,证实了Lyz基因和GFP已整合到苜蓿基因组中并得到表达。主要研究成果如下:1、运用正交试验设计,建立苜蓿下胚轴愈伤组织诱导的最佳培养基。结果表明:对于秘鲁苜蓿和甘农3号苜蓿,最适愈伤组织诱导的培养基均为MS + 2,4-D（2.0mg/L） + 6-BA （0.5mg/L） + NAA （1.0mg/L）,各因素影响程度皆为6-BA > NAA > KT。对于和田苜蓿,最适愈伤组织诱导的培养基为MS + 2,4-D （2.0mg/L） + 6-BA （1.0mg/L） + KT （1.0mg/L） +NAA （1.0mg/L）,各因素影响程度为6-BA > KT > NAA。2、构建了GFP和Lyz基因的植物表达载体PBI121-Lyz-GFP。将GFP基因插入到质粒载体PBI121-Lyz中,构建了含有卡那霉素抗性选择标记的植物表达载体PBI121-Lyz-GFP,并通过液氮冻融法将其导入农杆菌LBA4404。3、遗传转化体系的建立。以培养7天的和田苜蓿的无菌苗下胚轴为外植体,以农杆菌菌株为介体,优化的基因转化体系如下:Kan筛选浓度定为4050 mg/L;抑菌剂选取Carb为宜,愈伤诱导阶段浓度为200 mg/L;用于转化的侵染时间为10 min;外植体预培养时间为3 d;与农杆菌共培养3 d。经筛选,得到69块具有卡那霉素抗性的愈伤组织,经PCR扩增和荧光显微镜检测证明重组基因已成功转化到和田苜蓿愈伤组织中。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 第一章 文献综述
• 1 苜蓿组织培养研究进展
• 1.1 基本培养基的选择
• 1.2 外植体的选择
• 1.3 激素配比
• 1.3.1 愈伤组织的诱导
• 1.3.2 愈伤组织的分化
• 1.4 紫花苜蓿再生体系建立存在的问题
• 2 植物抗病基因工程研究进展
• 2.1 植物抗真菌基因工程
• 2.1.1 几丁质酶（Chitinase）和β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-Glucanase）
• 2.1.2 PR 蛋白，核糖体灭活蛋白（RIP）
• 2.1.3 植物抗毒素（植物保卫素，Phytoalexin）
• 2.1.4 多聚半乳糖醛酸抑制蛋白（PGIP）
• 2.1.5 草酸氧化酶和葡萄糖氧化酶
• 2.1.6 防御素（Defensin）和抗菌肽（Antibacterial Peptide）
• 2.1.7 其它类抗菌蛋白
• 2.2 植物抗细菌病基因工程
• 2.2.1 昆虫裂解肽
• 2.2.2 溶菌酶（lysozyme）
• 2.2.3 其他抗菌肽
• 2.3 植物抗病基因工程的前景展望及存在问题
• 2.3.1 植物抗病基因工程的前景展望
• 2.3.2 应用植物抗病害基因工程时应注意的问题
• 3 溶菌酶的研究进展
• 3.1 溶菌酶的理化性质
• 3.2 溶菌酶的分布
• 3.3 溶菌酶的结构
• 3.4 溶菌酶的种类及作用
• 3.4.1 动物溶菌酶
• 3.4.2 植物溶菌酶
• 3.4.3 微生物溶菌酶
• 3.5 溶菌酶的抗菌谱
• 3.6 溶菌酶的应用
• 3.6.1 溶菌酶在应用过程中的优点
• 3.6.2 溶菌酶主要的应用方面
• 4 绿色荧光蛋白（GFP）研究进展
• 4.1 GFP 基础理论研究进展
• 4.2 GFP 的结构、生化特性、发光机制、光谱特性
• 4.2.1 结构
• 4.2.2 生化特性
• 4.2.3 发光机制
• 4.2.4 光谱特性
• 4.3 GFP 的改进
• 4.4 GFP 的应用
• 4.4.1 应用特点
• 4.4.2 GFP 在分子生物学研究中的应用
• 4.5 问题及展望
• 第二章 不同苜蓿品种愈伤组织诱导培养基的优化
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 供试植物材料
• 1.1.2 植物激素
• 1.1.3 主要实验设备
• 1.1.4 基本培养基
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 无菌苗的获得
• 1.2.2 培养方法与条件
• 1.2.3 实验设计
• 1.2.4 数据统计及分析方法
• 2 结果与分析
• 2.1 不同培养基对秘鲁苜蓿愈伤组织诱导的影响
• 2.2 不同培养基对甘农3 号苜蓿愈伤组织诱导的影响
• 2.3 不同培养基对和田苜蓿愈伤组织诱导的影响
• 3 讨论
• 3.1 优化培养基的意义
• 3.2 激素对愈伤组织诱导的影响
• 3.3 利用正交设计法筛选最适愈伤组织诱导培养基
• 4 小结
• 第三章 植物表达载体P81121-Lyz-GFP 的构建
• 1 实验材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌种和质粒
• 1.1.2 常用酶和生化试剂
• 1.1.3 主要仪器设备
• 1.2 基本培养基
• 1.3 溶液配制
• 2 引物设计和技术路线
• 2.1 引物的设计
• 2.2 植物表达载体的构建策略
• 2.3 P81121-Lyz-GFP 构建的基本技术路线
• 3 实验方法
• 3.1 小量碱裂解法提取质粒
• 3.2 PCR 扩增
• 3.2.1 试剂
• 3.2.2 PCR 反应体系
• 3.2.3 PCR 反应条件
• 3.2.4 琼脂糖凝胶电泳分析PCR 结果
• 3.3 PCR 产物回收
• 3.4 GFP 基因PCR 产物与PUCm-T 载体的连接与转化
• 3.4.1 连接反应
• 3.4.2 大肠杆菌感受态的制备及转化
• 3.5 PUCm-T-GFP 和P81121-Lyz 的酶切及纯化
• 3.5.1 PUCm-T-GFP 的酶切处理及纯化
• 3.5.2 P81121-Lyz 的酶切处理及纯化
• 3.6 PUCm-T-GFP 与P81121-Lyz 酶切产物的连接与转化
• 3.6.1 PUCm-T-GFP 与P81121-Lyz 酶切产物的连接
• 3.6.2 载体转化至大肠杆菌DH5α
• 3.7 重组质粒P81121-Lyz-GFP 的PCR 和酶切检测
• 3.7.1 重组质粒的PCR 检测
• 3.7.2 重组质粒的酶切检测
• 3.8 植物表达载体向农杆菌的转化
• 3.8.1 根癌农杆菌感受态细胞的制备
• 3.8.2 液氮冻融法直接转化农杆菌
• 3.8.3 阳性克隆的筛选和鉴定
• 4 结果与分析
• 4.1 克隆目的基因
• 4.1.1 GFP 基因片段的PCR 扩增结果
• 4.1.2 PUCm-T-GFP 基因的扩增和双酶切
• 4.2 植物表达载体P81121-Lyz-GFP 的构建及检测
• 4.3 植物表达载体P81121-Lyz-GFP 转化根癌农杆菌
• 5 讨论
• 5.1 关于植物表达载体P81121-Lyz-GFP 构建策略的讨论
• 5.1.1 表达载体的改造
• 5.1.2 研究方法的改进
• 5.1.3 P81121-Lyz-GFP 表达载体的特点
• 5.2 关于对农杆菌的转化及其鉴定
• 第四章 农杆菌介导的P81121-Lyz-GFP 基因对紫花苜蓿的转化研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 质粒和农杆菌菌株
• 1.1.3 农杆菌培养基
• 1.1.4 培养基类型
• 1.1.5 抗生素
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 卡那霉素浓度对和田苜蓿种子萌发的影响
• 1.2.2 筛选培养中卡那霉素选择压的确定
• 1.2.3 筛选培养中抗生素种类及其浓度的对农杆菌增殖的影响
• 1.2.4 农杆菌介导的基因转化方法
• 1.2.5 转化体系的建立
• 1.3 转基因愈伤组织的鉴定
• 1.3.1 PCR 鉴定
• 1.3.2 荧光显微镜下的鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 卡那霉素浓度对和田苜蓿种子萌发的影响
• 2.2 筛选培养中卡那霉素选择压的确定
• 2.3 筛选培养中抗生素种类及其浓度的确定
• 2.4 转化体系的建立
• 2.4.1 侵染时间对转化率的影响
• 2.4.2 预培养时间对转化率的影响
• 2.4.3 共培养时间对转化率的影响
• 2.5 和田苜蓿转化愈伤组织的鉴定
• 2.5.1 PCR 分子鉴定
• 2.5.2 转基因愈伤组织的GFP 检测结果
• 3 讨论
• 3.1 农杆菌菌株对转化的影响
• 3.2 抗生素对愈伤组织诱导的影响
• 3.3 关于绿色荧光蛋白的检测
• 3.4 后续研究工作展望
• 4 小结
• 参考文献
• 致谢
• 附图
• 作者简介
• 导师简介
• 指导老师简介