蓝狐多重感染的病原学及主要病原的分子生物学特性研究

论文摘要

近年来,随着我国毛皮动物规模化养殖业的不断扩大,由病原细菌所引起的狐类感染,常表现出流行面广、发病率和死亡率高的特点。传染性疾病,尤其是细菌性疾病的多重感染发生日益频繁、越来越普遍,给毛皮动物养殖生产带来了较大的经济损失,严重地威胁到毛皮动物养殖业的持续发展。2006-2007年间,山东6个地区不同狐群养殖场养殖的母狐出现空怀、流产、出血性肺炎等症状病变类似的疫情。为了进一步探讨引起这场规模化狐场发生疾病的原因,本研究开展了流行病学调查,病原学检查,细菌多重感染的状况分析及间接荧光抗体检测等方法的建立,并对其主要病原进行16SrRNA序列测定和系统进化性分析,为规模化种狐场多重感染的疾病诊断与防治提供了理论依据。本研究共分三部分:一、规模化蓝狐养殖场细菌感染的病原学检测及其多重感染的状况分析2006-2007年间,山东6个地区不同狐群养殖场养殖的母狐出现空怀、流产、出血性肺炎等症状病变类似的疫情,给养殖场造成了巨大经济损失。通过对其养殖场（共计饲养蓝狐2.2万余只）进行流行病学调查,对送检的236只病死蓝狐进行细菌和病毒学检查,及犬瘟热（CDV）、犬细小病毒（CPV）快速诊断试纸条的检测,从被检病料中主要分离到绿脓杆菌（86%）、大肠杆菌（34.3%）、沙门氏菌（25.8%）和普通变形杆菌（8.5%）四种病原菌,病毒检查与试纸条检测皆为阴性,人工感染小鼠的致病性试验结果表明四种病原菌皆为致病菌;通过细菌分离率及共感染率的统计分析,发现病狐群同时存在大肠杆菌、沙门氏菌、普通变形杆菌和绿脓杆菌的二重感染（45.8%）、三重感染（3.8%）、甚至四重感染（0.4%）的情况,尤其是以绿脓杆菌感染为主的多重感染,已成为影响山东地区毛皮动物养殖疫病的主要病因之一。二、蓝狐绿脓杆菌主要血清学诊断方法的建立与临床应用取上述试验所分离的主要病原菌绿脓杆菌的代表菌株ZB4,分别制备全菌（OK）抗原及菌体（O）抗原,经分别强化免疫接种家兔制备高效价抗血清,进行与待检菌株的玻片凝集反应、免疫荧光抗体反应（IFA）及琼脂扩散试验（AGP）等方面的免疫检验,结果在同种细菌间的荧光抗体检验显示出了特异的黄绿色荧光反应;玻片凝集反应中出现了特异凝集;在琼脂扩散检验中出现特异的免疫沉淀线。本研究建立了蓝狐绿脓杆菌玻板凝集、IFA、AGP的快速诊断方法,补充了传统细菌学检测的方法,为这些病原的快速、准确诊断奠定了基础。三、蓝狐绿脓杆菌ZB4株16SrRNA基因的序列测定及系统进化分析病原学研究结果表明绿脓杆菌是影响规模化蓝狐养殖场多重感染的主要病原之一,为进一步研究其分子生物学特性,本试验利用原核生物16SrRNA基因通用引物对分离纯化的蓝狐致病性绿脓杆菌菌株ZB4进行16SrRNA基因的克隆及序列分析。采用DNAstar软件将获得的序列与选取的核苷酸同源性较高的序列进行同源性比对,采用MEGA（3.1）软件生成同源序列的进化树。结果显示该菌株与假单胞菌属的9个代表菌株的同源性均很高,在98.7%～99.2%之间,在所构建的系统进化树上,ZB4菌株与绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）（AJ249451）的距离最近,位于同一分支,其同源性达99.2%。从分子水平上鉴定菌株ZB4为绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1. 概述
• 2. 蓝狐细菌性疾病的多重感染
• 3. 蓝狐常见多重感染的病原菌及其所致疾病
• 4. 病原细菌检验与分类方法
• 4.1 传统的细菌学检验
• 4.2 血清学检查
• 4.3 分子生物学技术
• 5. 本研究的内容、目的及意义
• 试验一 山东规模化蓝狐养殖场细菌感染的病原学检测及多重感染情况分析
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 被检材料
• 1.1.2 培养基及主要试剂
• 1.1.3 试验动物
• 1.1.4 有关培养基的配制
• 1.1.5 仪器设备
• 1.2 流行病学调查
• 1.3 病原学检查
• 1.3.1 细菌的分离与纯培养
• 1.3.2 细菌的鉴定
• 1.3.3 病毒学检测
• 1.3.4 细菌多重感染的状况统计及分析
• 2 结果
• 2.1 流行病学调查
• 2.2 细菌学检查
• 2.3 病毒检测
• 2.4 蓝狐细菌多重感染状况统计及分析
• 3 小结与讨论
• 试验二 蓝狐绿脓杆菌主要血清学诊断方法的建立和临床应用
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 试验动物
• 1.1.3 培养基及主要试剂
• 1.1.4 有关培养基和溶液的配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 玻板凝集反应
• 1.2.2 回归动物试验
• 1.2.3 间接荧光抗体检验
• 1.2.4 琼脂扩散试验
• 1.2.5 药物敏感性测定
• 2 结果
• 2.1 玻板凝集反应结果
• 2.2 回归动物试验结果
• 2.3 间接荧光抗体检验结果
• 2.4 琼脂扩散试验结果
• 2.5 药物敏感性检验结果
• 3 小结与讨论
• 试验三 蓝狐绿脓杆菌 ZB4 株 16SrRNA 基因的 序列测定和系统进化分析
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 有关培养基和溶液的配制
• 1.1.4 PCR 引物
• 1.1.5 仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 细菌基因组 DNA 的提取
• 1.2.2 引物设计与合成
• 1.2.3 PCR 反应
• 1.2.4 PCR 产物的回收
• 1.2.5 定量及连接
• 1.2.6 TGI 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 1.2.7 连接产物的转化
• 1.2.8 重组克隆细菌的扩增
• 1.2.9 阳性克隆序列测定及分析
• 2 结果
• 2.1 ZB4 菌株 16SrRNA 的 PCR 扩增
• 2.2 序列分析结果
• 3 小结与讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介
• 攻读硕士学位期间发表论文情况