Tet-on系统调控分离酶上调表达对Hela细胞生物学性状影响的初步研究

论文摘要

一、研究背景和目的姐妹染色单体的分离是由分离酶（separase）水解粘合素（cohesin/SCC1）后发生。姐妹染色单体的分离是一精确时空调控事件,分离的紊乱会造成遗传物质传递的不稳定性,导致细胞的非整倍性（aneuploidy）,从而引起细胞或个体的死亡或病态[1]。现在普遍认同一种保守的机制参与姐妹染色单体的分离:随着姐妹染色单体复制的完成,姐妹单体之间也随之建立由cohesion维持的结合[2]。有丝分裂后期,体内后期促进复合物（APC/C）泛素化降解保全素（securin）[3、4],从而促使激活的separase裂解cohesion,引发姐妹染色单体的分离[5、6]。随着研究的深入,人们对separase在真核细胞姐妹染色单体分离中的机制有了进一步认识:脊椎动物cohesin的解离分两步:第一步发生在前期和前中期,主要裂解大部分染色体臂上的cohesin,此过程主要涉及Pole-like kinase（Plk1）和Aurora-B,尤其Plk1对Scc3和SA2亚基的磷酸化是cohesin在分裂前期和前中期裂解所必需的[7];第二步在后期,中心粒区域的cohesin通过securin—separase通路而降解[8]。着丝粒处的cohesin没有被前期裂解途径降解的原因在于shugoshins对其的保护[9、10]。Separase表达异常影响细胞基因组不稳定性、肿瘤形成敏感性。Waizenegger等的研究显示,人类细胞通过RNAi抑制Esp1表达后,形成了含有大叶状核的多倍体细胞,在这些细胞有丝分裂过程中,许多细胞都含有不分离的姐妹染色单体[11]。Karin G. Wirth等发现小鼠separase等位基因条件敲除能够阻止染色体的分离,但是无法阻止有丝分裂的其他特征,如胞质分离,染色体的复制等[12]。Jennifer L. Shepard等通过诱变剂N-甲基N-硝基N-亚硝基-胍作用于separase基因突变的斑马鱼,结果所有肿瘤的发生率增加0.25倍,而上皮性肿瘤发生率增加0.8倍[13]。Separase能促进细胞凋亡的发生。Uhlmann等指出Esp1（separase）功能类似caspases,二者同属于半胱氨酸蛋白酶,二者在C端含有保守的半胱氨酸残基,该残基正是Caspases的催化活性基团[14]。Pati和Chen在2002年分别提出: cohesion/Rad21亚基的裂解会引起细胞凋亡[15、16]。2005年Atienza JM进一步报道:对Rad21进行RNA干扰,减少Rad21 mRNA的表达后发现肿瘤细胞增殖受到抑制,凋亡增加[17]。Hui Yang等研究发现,在过氧化氢诱导下,酵母细胞中类似caspases的separase通过切割类似Rad21的Mcd1诱导凋亡[18]。separase在细胞遗传物质的传递、基因组不稳定性、肿瘤敏感性及凋亡中的重要作用引起我们极大关注。但是目前国内、外的研究集中在正常真核细胞separase功能方面,而关于separase在肿瘤细胞中的作用还没有文献报道。既然有研究发现分离酶低表达或不表达可以增加肿瘤易感性,我们就假设如果让本来separase低表达的肿瘤细胞高表达,那么其生物学性状会不会发生改变呢?我们选择Hela细胞作为研究的细胞株,主要是其异常染色体均数多达85条,和正常宫颈上皮细胞染色体46条差别明显,有利于观察染色体改变。随着研究的进展,我们证实了上调表达的separase可以在一定程度上逆转肿瘤细胞的恶性程度,那么这种现象是否和separase上调表达肿瘤细胞的凋亡改变有关呢?本研究就Hela细胞（肿瘤细胞）中separase上调表达后对生物学性状影响做初步的研究。二、方法和结果1.Tet-on系统表达调控模型的建立:质粒PSK-Esp1用EcoRⅠ, SacⅡ双酶切,胶回收目的片段Esp1,定向克隆插入pTRE-d2EGFP,转入大肠杆菌后挑出正确的重组子,采用XhoⅠ, SphⅠ双酶切鉴定插入方向,测序鉴定其序列的正确性,成功构建Esp1-pTRE-d2EGFP表达载体。利用FuGENE 6脂质体转染PTet-on质粒,转染24h后加G418 （200ng/ ml） ,筛选2周后挑选单个细胞克隆扩大培养。将Esp1-pTRE-d2EGFP质粒与PTK-Hyg质粒按摩尔比为20∶1转染已经成功转染PTet-on质粒的Hela细胞中,转染24h后加G418 （600μg/ ml ）,潮霉素（200μg/ ml ）,筛选2周后挑选单个细胞克隆扩大培养。用FQ-PCR、WB分别在mRNA和蛋白水平上检测目的基因Esp1的表达水平,结果发现强力霉素（DOX）的最适诱导浓度为200ng/ ml,Esp1mRNA从0.293增加至5.162（Esp1/GAPDH）,蛋白表达转染后明显增加。2.Esp1上调表达对Hela细胞倍性的影响:收集最适浓度200ng/ ml DOX诱导下的Hela细胞,采用秋水仙素法制备染色体,然后人工光学显微镜下计数染色体,同时利用染色体工作分析站自动分析计数染色体。采用荧光染色细胞仪分析Hela细胞DNA含量、倍性及细胞周期变化。结果发现:Esp1上调表达后,Hela细胞染色体均数从83条降到71条;Hela细胞倍性DI（DNA index）从2.20降到1.89。3.Esp1上调表达对Hela细胞凋亡的影响:保持最适浓度200ng/ ml DOX压力下,分别选择药物Etoposide（VP-16）和X-ray诱导Hela细胞凋亡,采用FITC-Annexin V凋亡试剂盒处理,流式细胞仪上机检测凋亡。结果发现在VP-16诱导下,Hela细胞凋亡率从转染前的2.3%增加到转染后的19.4%;在X-ray诱导下,凋亡率从转染前的3.8%增加到转染后的14.8%。三、结论1.通过建立Tet-on系统表达调控模型,我们发现:随着DOX浓度的增加,目的基因Esp1的表达同步增加,但是低于或者高于DOX有效浓度,Esp1的表达变化不明显。该系统的建立,有助于我们观察目的基因Esp1从低浓度到高浓度表达对Hela细胞生物学性状的影响,可以使我们能够在定量的水平上调控分离酶的表达,为研究基因功能、疾病基因治疗打下基础。2.Esp1基因过表达后,观察到Hela细胞染色体数减少,FACS证实DNA倍性降低。有文献报道,separase和cohensin的亚单位Rad21一起能够修复损伤的DNA及促进染色体的正确分离[37]。结合我们的发现,提示高表达separase在促进分裂中期姐妹染色单体的分离中发挥一定的作用,在一定程度上可以逆转Hela细胞的恶性程度。3.Esp1基因过表达,X-ray和VP-16诱导下可以使Hela细胞的凋亡率增加。说明在两种不同的凋亡通路诱导作用下都可以使凋亡增加,那么分离酶在凋亡通路中发挥作用的位点必定不在X-ray和VP-16诱导凋亡通路交叉点的前面而是在其后面。目前我们还不清楚高表达的separase在使肿瘤细胞凋亡率增加和减少染色体数目、降低DNA倍性在抑制肿瘤细胞恶性程度上发挥作用是平行关系还是促进关系。本实验构建了可调控、诱导表达、无多效性和低背景表达等优点的Tet-on系统表达调控模型[19],,并动态观察了随Esp1基因表达的线性增加,Hela细胞生物学性状的改变,说明高表达的separase能一定程度上抑制Hela细胞的染色体的数目,在X-ray和VP-16诱导下上调表达的separase增加Hela细胞的凋亡。下一步,我们将通过动物体内实验,观察不同浓度DOX诱导Tet-on系统Esp1基因表达改变对体内肿瘤细胞的生物学性状的影响,进一步探讨分离酶在致瘤和肿瘤转归中的作用机制。

论文目录

• 英文缩写简表
• 英文摘要
• 中文摘要
• 正文 Tet-on 系统调控分离酶上调表达对Hela 细胞生物学性状影响的初步研究
• 前言
• 第一部分 Tet-on 系统表达调控模型的建立及表达
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 第二部分 上调表达的分离酶对Hela 细胞染色体倍性的影响
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 第三部分 分离酶上调表达对Hela 细胞凋亡的影响
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 全文总结
• 致谢
• 参考文献
• 附录 常用的实验方法
• 文献综述 分离酶作用机制的研究进展
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的文章