应用酵母双杂交系统筛选与CERKL相互作用的蛋白

应用酵母双杂交系统筛选与CERKL相互作用的蛋白

论文摘要

视网膜色素变性(RP)是一组以感光细胞进行性丧失为表现的遗传异质性疾病。1998年由一个西班牙的研究组,通过对常染色体隐性视网膜色素变性家系(ARRP)进行连锁分析,将该家系的致病基因定位于2q31-2q33,并命名为RP26。后在两个无血缘关系的RP西班牙家系中发现该位点的新克隆基因CERKL存在相同的纯合突变,认为该基因是一个新的视网膜色素变性致病基因。目前有关CERKL的文献报道只有5篇,对其正常的生理功能,以及突变后所引起视网膜色素变性(RP)的分子机制都不清楚。为了研究该基因在体内的生物学功能,揭示其在视网膜中的代谢途径,本研究克隆了CERKL基因全长,应用酵母双杂交系统筛选与CERKL相互作用的蛋白质,以期通过这一线索获得CERKL基因的功能信息,为研究CERKL致病机理提供分子基础。实验首先通过巢式PCR方法从HeLa细胞cDNA中扩增得到CERKL基因全长,然后将其作为目的基因构建筛选时所用的诱饵载体pGBKT7-CERKL。转化酵母AH109细胞,检查细胞毒性和自激活作用。再将pGBKT7-CERKL和来源于人胰腺的cDNA文库质粒顺序转化酵母AH109细胞中,通过营养缺陷型培养基进行阳性克隆的筛选。随后将所得的560个克隆通过多次营养筛选、酶切鉴定、α-gal分析、一对一酵母双杂交系统的回复性实验排除假阳性克隆。最后借助数据库中的BLAST工具对候选阳性克隆的测序结果进行同源性分析,确定可能发生相互作用的蛋白质。经过筛选和多重验证,最后确定了2种相关蛋白,分别为CTRC(Homo sapiens chymotrypsin C preproprotein)、EIF3S9(Homo sapiens eukaryotic translation initiation factor 3 subunit 9)。总之,本研究在世界上首次发现2种可能与CERKL相互作用的蛋白质,对这些蛋白的最终确认,以及对它们与CERKL之间相互作用机制的进一步研究,必将为我们认识这一基因的结构与功能,阐明其引起RP的致病机理创造条件。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 1 绪论
  • 1.1 视网膜色素变性(Retinitis Pigmentosa,RP)及其临床研究
  • 1.2 视网膜色素变性的分子遗传学研究与基因CERKL
  • 1.3 蛋白质相互作用与酵母双杂交
  • 1.4 应用酵母双杂交系统筛选与目的蛋白CERKL 相互作用的蛋白质
  • 2 材料与方法
  • 2.1 材料
  • 2.2 方法
  • 3 实验结果
  • 3.1 目的基因的扩增及诱饵载体的构建
  • 3.2 酵母菌株AH109 的表形鉴定
  • 3.3 诱饵载体 pGBKT7-CERKL 自激活及毒性检测
  • 3.4 文库滴度及扩增结果
  • 3.5 文库筛选结果
  • 3.6 测序及比对结果
  • 4 讨论
  • 5 总结与展望
  • 致谢
  • 参考文献
  • 附录 主要英文缩略词
  • 相关论文文献

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