论文摘要
背景动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是一个多因素导致的严重威胁人类健康和生命的心血管疾病,近年来,国内外大量研究表明,高同型半胱氨酸（Homocysteine,Hcy）血症是AS和血栓栓塞性疾病的一个新的独立危险因素。降低血浆Hcy水平及逆转由此而产生的病理变化成为近年来AS防治的热点。AS是一多因素、多基因引起的复杂的慢性炎症性疾病,涉及损伤的内皮细胞与单核巨噬细胞、平滑肌细胞之间的相互作用,以及局部产生的大量细胞因子、生长因子的网络调控,其中黏附分子、趋化因子、生长因子等在AS发生发展过程中具有重要作用。近年研究表明,高Hcy血症导致AS发生的机制与其诱发血管壁炎症反应有关,Hcy可诱导核因子-kappa B（Nuclear factor-kappa B,NF-κB）活化,上调血管内皮细胞、平滑肌细胞、单核细胞等表达细胞间黏附分子-1（Intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1）、单核细胞趋化蛋白-1（Monocytechemoattractant protein-1,MCP-1）、转化生长因子-β1（Transformation growthfactor-β1,TGF-β1）、基质金属蛋白酶-9（Matrix metalloproteinase-9,MMP-9）等,从而促进单核细胞与血管内皮的黏附,平滑肌细胞的增殖及胶原合成,参与AS的发生和发展。益肾活血胶囊（Yishenhuoxue Capsule,YC）是临床治疗高Hcy血症的中药复方制剂。本研究以高蛋氨酸饮食诱导兔高Hcy血症并制备AS动物模型,以降低血浆Hcy水平的常用药物叶酸、VitB6、VitB12联合治疗作为阳性对照,通过对高Hcy血症所致AS兔腹主动脉内膜、中膜病理改变及超微结构的观察,以及应用荧光实时定量PCR和免疫组化技术检测ICAM-1、MCP-1、TGF-β1和MMP-9 mRNA及蛋白表达的改变,并用Western blot和免疫组化检测NF-κB抑制因子-a（Inhibitorof NF-κB-a,IκB-a）蛋白表达及NF-κB核移位的变化,探讨益肾活血胶囊对Hcy所致血管壁炎症的抑制作用,为其临床防治高Hcy血症及AS提供科学依据。目的观察益肾活血胶囊对高Hcy血症所致AS兔血浆Hcy水平、腹主动脉壁形态学及超微结构的改变、血管壁炎症因子ICAM-1、MCP-1、TGF-β1和MMP-9基因和蛋白表达的变化、以及对NF-κB活化的影响,探讨益肾活血胶囊对高Hcy血症及其所致AS的防治作用及机理。方法1.试验动物:2～3月龄、体重2.0～2.5 kg雄性纯种新西兰兔。2.建立模型:以充盈球囊损伤腹主动脉内膜后,2%高蛋氨酸饲料喂养动物5个月,建立高Hcy血症及AS动物模型。3.动物分组:将56只新西兰兔随机分为正常组、模型组、益肾活血胶囊预防组（预防组）、益肾活血胶囊小剂量组（小剂量组）、益肾活血胶囊中剂量组（中剂量组）、益肾活血胶囊大剂量组（大剂量组）、西药(叶酸、VitB12、VitB6)对照组,共7组。4.观察指标:（1）高效液相色谱技术检测各实验组兔血浆Hcy浓度;（2）腹主动脉壁病理学观察;（3）腹主动脉壁形态学指标检测:平均内膜厚度（Intimalthickness,IT）、中膜厚度（Medial thickness,MT）、内膜面积（Intimal area,IA）、内膜面积与中膜面积比（Intimal area/medial area,IA/MA）;（4）透射电镜观察腹主动脉壁中膜平滑肌细胞超微结构;（5）实时定量RT-PCR法检测腹主动脉ICAM-1、MCP-1、TGF-β1和MMP-9的mRNA表达;（6）免疫组化法观察ICAM-1、MCP-1、TGF-β1、MMP-9的蛋白表达;（7）NF-κB活化情况检测:Westernblot检测IκB-a蛋白表达及免疫组化法检测NF-κB核表达情况。结果1.各实验组兔血浆Hcy浓度变化与正常对照组相比,模型组兔血浆Hcy浓度明显升高;各药物处理组兔血浆Hcy浓度较模型组均有不同程度下降,其中预防组下降最为显著（P＜0.01）,其次为大剂量组（P＜0.01）;预防组和大剂量组与西药对照组相比,差异具有统计学意义（P＜0.05）;小剂量组和中剂量组与西药对照组相比差异无显著性（P均＞0.05）。2.腹主动脉壁切片光镜下HE染色观察正常对照组兔腹主动脉血管壁内膜、中膜、外膜三层结构明显,内膜完整、无增厚,内皮下无脂质沉积,中膜VSMCs细长呈梭形,细胞核蓝染,同心圆状排列整齐;模型组兔腹主动脉壁内膜明显增厚,内皮下可见泡沫细胞聚集,中膜VSMCs排列紊乱,单位面积细胞核数量增多;预防组及各药物治疗组兔腹主动脉内膜增厚与模型组相比均有所减轻,中膜VSMCs排列欠规则,单位面积细胞核数目略增多。3.腹主动脉形态学指标比较3.1内膜厚度（IT）比较:与正常对照组相比,模型组兔腹主动脉IT明显增加（P＜0.01）;与模型组相比,各药物处理组腹主动脉IT均有不同程度下降,其中预防组和大剂量组下降尤为明显（P均＜0.01）,但是西药对照组和小剂量组IT与模型组相比,差异无显著性（P均＞0.05）;预防组和大剂量组IT与西药对照组相比,差异具有统计学意义（P均＜0.05）。3.2中膜厚度（MT）比较:与正常对照组相比,模型组及各药物组兔腹主动脉MT虽有不同程度增加,但差异无显著性（P均＞0.05）。3.3内膜面积（IA）比较:与正常对照组相比,模型组兔腹主动脉IA明显增加（P＜0.01）;与模型组相比,各药物处理组IA均有所下降,其中预防组和大剂量组下降尤为明显（P均＜0.01）,然而西药对照组IA与模型组相比,差异无显著性（P＞0.05）;预防组IA与西药对照组相比,差异具有统计学意义（P＜0.05）。3.4内膜与中膜面积比（IA/MA）:与正常对照组相比,模型组兔腹主动脉IA/MA显著增加（P＜0.01）;与模型组相比,各药物处理组兔腹主动脉IA/MA均明显下降（P均＜0.05）;预防组、大剂量组与西药对照组相比差异具有显著性（P均＜0.05）。4.腹主动脉壁中膜平滑肌细胞超微结构改变正常组兔血管中膜平滑肌细胞呈纺锤形,密斑密体排列规则,肌丝含量丰富,线粒体、内质网无肿胀,呈典型的收缩型细胞特征;模型组可见血管平滑肌细胞向内膜迁移,核固缩,肌丝减少,线粒体明显肿胀,呈空泡状,粗面内质网、核糖体和高尔基体等细胞器增多,呈明显的合成型细胞特征;益肾活血胶囊不同处理组,中膜平滑肌细胞形态均有不同程度的改善,与模型组相比,线粒体肿胀减轻,密斑密体可见,肌丝含量增加,恢复收缩型细胞特征;西药对照组平滑肌细胞形态改善不明显。5.腹主动脉壁ICAM-1、MCP-1、TGF-β1、MMP-9 mRNA表达水平比较（1）ICAM-1 mRNA表达比较:与正常对照组相比,模型组兔血管壁ICAM-1mRNA表达显著升高（P＜0.01）;各药物处理组ICAM-1 mRNA表达较模型组均有不同程度下降,其中预防组下降最为显著（P＜0.01）,其次为大剂量组（P＜0.01）,小剂量组ICAM-1 mRNA表达与模型组相比,差异无统计学意义（P＞0.05）;预防组和大剂量组与西药对照组相比差异具有显著性（P均＜0.05）。（2）MCP-1 mRNA表达比较:与正常对照组相比,模型组兔血管壁MCP-1mRNA表达显著升高（P＜0.01）;与模型组相比,各药物处理组MCP-1 mRNA表达均显著下降（P均＜0.05）;预防组、中剂量组和大剂量组与西药对照组比较,差异有统计学意义（P均＜0.05）。（3）TGF-β1mRNA表达比较:与正常对照组相比,模型组兔血管壁TGF-β1mRNA表达显著升高（P＜0.01）;与模型组相比,各药物处理组TGF-β1 mRNA表达均明显下降（P均＜0.05）;预防组与西药对照组相比,差异有统计学意义（P＜0.05）。（4）MMP-9 mRNA表达比较:与正常对照组相比,模型组兔血管壁MMP-9mRNA表达明显升高（P＜0.01）;与模型组相比,各药物处理组MMP-9 mRNA表达均显著下降（P均＜0.01）;预防组和大剂量组与西药对照组比较,差异具有统计学意义（P均＜0.05）。6.腹主动脉壁ICAM-1、MCP-1、TGF-β1、MMP-9蛋白表达水平比较（1）ICAM-1蛋白表达比较:与正常对照组相比,模型组兔血管壁ICAM-1蛋白表达显著升高（P＜0.01）;小剂量组和西药对照组兔ICAM-1蛋白表达与模型组相比,差异无显著性（P＞0.05）,预防组、中剂量组和大剂量组则较模型组明显下降（P均＜0.05）;预防组和大剂量组兔ICAM-1蛋白表达明显低于西药对照组,也显著低于小剂量组（P均＜0.01）。（2）MCP-1蛋白表达比较:与正常对照组相比,模型组兔血管壁MCP-1蛋白表达显著升高（P＜0.01）;与模型组相比,各药物处理组MCP-1蛋白表达均明显下降（P均＜0.01）;预防组和大剂量组与西药对照组比较,差异有统计学意义（P＜0.01）。（3）TGF-β1蛋白表达比较:与正常对照组相比,模型组兔血管壁TGF-β1蛋白表达显著升高（P＜0.01）;小剂量组、中剂量组和西药对照组兔TGF-β1蛋白表达与模型组相比,差异无统计学意义（P均＞0.05）,预防组和大剂量组TGF-β1蛋白表达较模型组明显下降（P均＜0.01）,且分别显著低于西药对照组、小剂量组和中剂量组（P均＜0.05）。（4）MMP-9蛋白表达比较:与正常对照组相比,模型组兔血管壁MMP-9蛋白表达显著升高（P＜0.01）;与模型组相比,各药物处理组MMP-9蛋白表达均有所下降（P均＜0.05）,其中以大剂量组下降最为显著（P＜0.01）,其次为预防组（P＜0.01）:大剂量组和西药对照组比较,差异有统计学意义（P＜0.01）。7.腹主动脉NF-κB活化情况比较Western blot分析显示,模型组兔血管壁IκB-a蛋白表达较正常对照组明显减少（P＜0.01）,提示高Hcy血症促进IκB-a蛋白的降解;与模型组相比,各药物处理组IκB-a蛋白表达均有不同程度的升高,其中以大剂量组回升最为显著（P＜0.01）,小剂量组IκB-a蛋白表达与模型组相比,差异无统计学意义（P＞0.05）;大剂量组IκB-a蛋白表达与西药对照组比较,差异有显著性（P＜0.01）。免疫组化显示,模型组兔血管壁NF-κB p65核表达比例较正常对照组明显增多（P＜0.01）,提示高Hcy血症促进NF-κB的核移位;与模型组相比,各药物处理组NF-κB p65核表达比例均有不同程度的下降,其中以预防组下降最为显著（P＜0.01）,其次为大剂量组（P＜0.01）;预防组NF-κB p65核表达比例与西药对照组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论1.益肾活血胶囊能够降低实验兔血浆Hcy水平。2.益肾活血胶囊具有明显的抗炎作用,可降低腹主动脉壁炎症因子ICAM-1、MCP-1、TGF-β1、MMP-9 mRNA和蛋白表达,其机制与降低血浆Hcy浓度及抑制核因子NF-κB活化有关。3.益肾活血胶囊能够抑制腹主动脉粥样硬化形成,表现为减轻血管内膜增厚,抑制中膜平滑肌细胞由收缩表型向合成表型转化,其机制与下调炎症因子ICAM-1、MCP-1、TGF-β1、MMP-9表达及抑制NF-κB活化有关。