论文摘要
目的：获得人β-防御素-2（hBD-2）基因并构建其真核表达载体，转染小鼠纤维母细胞（L929），检测重组hBD-2表达载体在L929细胞的表达，初步测定hBD-2的体外抗菌活性，为hBD-2基因转染和表达的研究奠定基础。方法：根据Genebank中hBD-2cDNA核苷酸序列设计PCR引物。采用RT-PCR方法从人宫颈癌组织获取人β-防御素-2基因，然后进行克隆，构建真核表达载体pCAGG-hBD-2，酶切鉴定并测序。用磷酸钙共沉淀法将pCAGG-hBD-2导入L929细胞，用RT-PCR法检测hBD-2基因mRNA的表达，用Western-blot法鉴定hBD-2基因的蛋白表达，最后采用Kirby-Bauer纸片扩散法检测重组hBD-2的抗菌活性。结果：1．RT-PCR扩增出约300bp的片段，测序分析结果表明与Genebank中登录的hBD-2cDNA序列一致，该片段为hBD-2编码全序列。2．所构建的真核表达载体pCAGG-hBD-2经酶切鉴定并测序，结果表明hBD-2基因与表达载体连接方向正确，可以进行转染。3．以pCAGG-hBD-2转染后L929细胞的总RNA为模板，进行RT-PCR反应，可扩增出特异性条带；Western blot检测呈阳性。表明我们构建的表达载体pCAGG-hBD-2转染L929细胞后，可正确表达hBD-2。4．K-B纸片法检测结果显示转染pCAGG-hBD-2细胞的上清液对金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）、铜绿假单胞菌（ATCC 27853）有明显的杀灭效应。结论：成功构建了hBD-2的真核表达载体pCAGG-hBD-2，转染pCAGG-hBD-2的小鼠纤维母细胞能高效表达hBD-2，转染细胞的上清液对金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）、铜绿假单胞菌（ATCC 27853）有杀灭作用。