单柱二维液相色谱复性变性溶菌酶及胰腺癌血清中肿瘤标志物的制备

论文摘要

高效液相色谱法是生物大分子分离纯化的手段,也是蛋白复性的有效方法。液相色谱的核心是色谱填料,它在蛋白分离和蛋白折叠液相色谱（PFLC）中起着重大作用。本文主要研究了用单柱二维液相色谱填料分别在弱阳离子交换色谱（WCX）和疏水相互作用色谱（HIC）模式下对还原变性溶菌酶的复性,同时采用离线单柱二维液相色谱对蛋清中的蛋白进行了分离纯化,以及采用SEC-RPLC制备胰腺癌血清中肿瘤标志物。主要包括以下4个部分。1文献综述：主要介绍了二维液相色谱和单柱二维液相色谱的概念及应用,论述蛋白折叠液相色谱法的原理,总结了溶菌酶复性的研究进展及胰腺癌早期诊断的研究进展,其中共引用文献64篇。2首次使用一根色谱柱分别在弱阳离子交换色谱（WCX）和疏水色谱（HIC）两种模式下对还原变性溶菌酶的折叠进行了研究。详细讨论了在两种分离模式下流动相中脲浓度,GSH/GSSG比例,pH,蛋白浓度及流动相流速对还原变性溶菌酶复性效率的影响。结果表明,使用此二维色谱柱,可分别在WCX和HIC模式下实现对还原变性溶菌酶的复性。在WCX模式下复性时,在蛋白浓度高达40 mg／mL的条件下,得到活性回收率和质量回收率分别为94.6%和96.0%,而在HIC模式下,蛋白浓度为5 mg／mL时,相应的活性回收率和质量回收率分别为79.8%和96.1%。表明该二维色谱柱能够应用于蛋白折叠液相色谱,可分别在WCX和HIC模式下对变性蛋白进行折叠。该二维色谱柱有望成为实现蛋白折叠液相色谱法的首选色谱柱。3首次使用一根色谱柱,采用离线单柱二维液相色谱技术对鸡蛋清中的3种蛋白质进行了的分离纯化。第一维采用离子交换色谱模式,可一步分离纯化得到抗生物素蛋白和溶菌酶,其纯度分别达到95.3%和95.6%。将在离子交换模式下不保留的组分再通过疏水色谱模式进行第二维分离,通过条件优化,一步可分离纯化得到球蛋白G2,其纯度可达到98.1%。而卵白蛋白和伴白蛋白则不能够完全分离。结果表明,采用单柱二维液相色谱技术,利用一根色谱柱就可以完成对复杂样品的二维分离和纯化。4采用800 mm×40.0 mm I.D.制备型排阻色谱柱对胰腺癌血清进行了预分离,再经反相色谱进一步分离纯化,得到分子量为5734Da的胰腺癌肿瘤差异蛋白,如将该蛋白进行进一步鉴定,有望成为新的肿瘤标志物。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 多维液相色谱技术及其在蛋白质组学中的应用
• 1.2.1 IEC-RPLC
• 1.2.2 SEC-RPLC
• 1.2.3 AFC-RPLC
• 1.2.4 IEC-HIC
• 1.3 单柱二维色谱技术
• 1.4 蛋白折叠液相色谱法及其复性原理
• 1.5 还原变性溶菌酶的复性研究进展
• 1.6 胰腺癌早期诊断技术的研究进展
• 1.7 本实验的主要研究工作
• 参考文献
• 第二章 单柱二维液相色谱对还原变性溶菌酶折叠规律的研究
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 仪器
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 溶菌酶的变性
• 2.1.4 离子交换色谱复性流动相
• 2.1.5 疏水色谱复性流动相
• 2.2 分析方法
• 2.2.1 Bradford法测定蛋白含量
• 2.2.2 F·I·P法测溶菌酶活性
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 脲浓度对还原变性溶菌酶折叠的影响
• 2.3.2 氧化还原剂对比例对还原变性溶菌酶折叠的影响
• 2.3.3 WCX模式下pH对还原变性Lys复性的影响
• 2.3.4 WCX和HIC模式下蛋白浓度对还原变性溶菌酶复性的影响
• 2.3.5 WCX和HIC模式下流速对还原变性溶菌酶复性的影响
• 2.3.6 最佳条件下对还原变性Lys的复性
• 2.3.7 还原变性溶菌酶复性动力学研究
• 2.4 本章小结
• 参考文献
• 第三章 单柱二维液相色谱在鸡蛋清分离纯化中的应用
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 仪器
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 材料
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 鸡蛋清的预处理
• 3.2.2 Bradford法测定蛋白含量
• 3.2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 3.2.4 蛋白纯度测定
• 3.2.5 MALDI-TOF MS检测
• 3.3 结果讨论
• 3.3.1 鸡蛋清的预处理
• 3.3.2 HIC模式对蛋清的分离
• 3.3.3 第一维WCX模式下分离条件的优化
• 3.3.4 第二维HIC色谱模式下分离条件的优化
• 3.3.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果和纯度扫描结果
• 3.3.6 质量回收率
• 3.4 本章小结
• 参考文献
• 第四章 胰腺癌血清中肿瘤标志物的制备
• 4.1 实验部分
• 4.1.1 仪器
• 4.1.2 试剂
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 血清的预处理
• 4.2.2 体积排阻色谱（SEC）
• 4.2.3 反相色谱（RPLC）
• 4.2.4 MALDI-TOF MS检测
• 4.3 结果讨论
• 4.3.1 半制备型和制备型排阻色谱柱对胰腺癌血清分离效果的比较
• 4.3.2 RPLC对SEC色谱B段馏分的分离
• 4.3.3 MALDI-TOF MS检测结果
• 4.4 章小结
• 参考文献
• 硕士期间主要成果
• 致谢