铜绿假单胞菌来源的脂肪酶的纯化与异源表达

论文摘要

脂肪酶（lipase,EC3.1.1.3）,是一种在油水界面上,催化三酯酰甘油水解,释放更少酯键的甘油酯或甘油及脂肪酸的一类酶,它广泛存在于动物、植物以及微生物中。它不只在脂代谢中发挥重要作用,它同时可催化多种酯的水解、合成及外消旋混合物的拆分。由于脂肪酶具有反应条件温和,优良的立体选择性,以及不会造成环境污染等优点,因此,近年来在食品、皮革、医药和洗涤剂等许多工业领域中都对其有广泛的需求。随着非水相酶学研究的日益深入,以及对脂肪酶介导的生化反应的认识,人类对于脂肪酶的研究又达到了一个新的高潮。本研究通过三丁酸甘油酯平板法,分离纯化了一株脂肪酶高产菌株,经16S rDNA鉴定为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）,命名为LIP-YUN。在优化其培养和产酶条件后,分离并纯化了原菌分泌于胞外的大小为34kDa的脂肪酶蛋白LIP-Y,并对其酶学性质进行了测定。该酶最适反应温度是60℃,最适pH值10.0,在pH4至12间稳定,当pH低于4时酶活力强烈下降。在温度稳定性方面,处于50℃时很稳定,但在60℃和70℃酶活力损失较快。同时发现除Mn2+、Cr3+、pb2+等对脂肪酶活性有轻微的抑制作用外,实验中采用的大多数金属离子和表面活性剂对酶活力有较强的促进作用,其中浓度为1%的尼纳尔溶液对脂肪酶活力有近10倍的促进作用。随后根据已报道的铜绿假单胞菌属的脂肪酶基因序列,设计两端特异引物,PCR扩增得到编码该脂肪酶的基因,全长为936bp,包含311个氨基酸。通过在NCBI上比对发现,其与已报道的铜绿假单胞菌脂肪酶基因的最高相似性达到99%。随后,构建了Lipase-pET-30原核表达载体,并转化到宿主菌株大肠杆菌BL21进行原核异源表达,成功表达了带有His-Tag大小37kDa的重组脂肪酶蛋白,酶活性测定表明具有脂肪酶活性,验证了克隆基因的生物学功能。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 脂肪酶的简介
• 1.2 微生物脂肪酶的来源及其基因
• 1.3 脂肪酶的性质
• 1.4 脂肪酶的分子结构和催化机理
• 1.5 脂肪酶的应用
• 1.5.1 脂肪酶在食品工业上的应用
• 1.5.2 脂肪酶在生物制药中的应用
• 1.5.3 脂肪酶在洗涤剂行业的应用
• 1.5.4 脂肪酶在饲料工业的应用
• 1.5.5 脂肪酶在生物能源产业的应用
• 1.6 铜绿假单胞菌来源的脂肪酶
• 1.7 问题与展望
• 1.8 研究的目的和意义
• 第二章 产脂肪酶的铜绿假单胞菌株筛选及其脂肪酶的纯化和酶学性质测定
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 工具酶和生化试剂
• 2.1.3 试剂盒
• 2.1.4 培养基及溶液配制
• 2.1.5 常用仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 产脂肪酶菌株的分离和筛选
• 2.2.2 铜绿假单胞菌DNA的提取
• 2.2.3 产脂肪酶菌株的鉴定
• 2.2.4 产脂肪酶原菌的培养和脂肪酶的纯化
• 2.2.5 原菌脂肪酶的活力检测
• 2.2.6 脂肪酶比活测定
• 2.2.7 脂肪酶的酶学性质研究
• 2.2.8 脂肪酶降解PNPP的动力学分析
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 产酶菌株的分离与筛选
• 2.3.2 菌株的16SrRNA基因鉴定
• 2.3.3 原菌产酶条件的摸索
• 2.3.3 原菌脂肪酶的纯化
• 2.3.4 原菌脂肪酶的性质测定
• 2.3.5 金属离子和表面活性剂对脂肪酶活力的影响
• 2.3.6 脂肪酶降解PNPP的动力学分析
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 第三章 脂肪酶基因的克隆及在大肠杆菌中的异源表达
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 脂肪酶基因全长的获得
• 3.2.2 原核表达重组子的构建
• 3.2.3 脂肪酶基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 脂肪酶编码基因的克隆
• 3.3.2 脂肪酶基因原核重组质粒的构建
• 3.3.3 重组质粒的PCR鉴定
• 3.3.4 脂肪酶基因在大肠杆菌中的表达
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 第四章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历