黄牛NPM1、SREBP1c基因的克隆、SNPs检测及其与生长性状的关系

论文摘要

本研究分别以南阳牛、秦川牛、郏县红牛、中国荷斯坦牛4个群体共1035份血样和秦川牛的组织样为材料,分别提取基因组DNA和RNA。运用反转录PCR、DNA测序和DNA序列分析,对牛的核仁磷酸蛋白1（NPM1）基因的CDS序列进行了克隆、鉴定与序列分析。运用黄牛混合DNA池测序技术和PCR-SSCP、PCR-RFLP、Forced PCR-RFLP相结合的方法,分析了黄牛核仁磷酸蛋白1（NPM1）基因（1个外显子构成）和固醇调节元件结合蛋白1（SREBP1c）基因（21个外显子构成）共2个候选基因22个外显子和20个内含子的遗传变异;并对南阳牛、秦川牛和郏县红牛3个群体在上述基因的SNPs位点与其生长性状进行了相关分析;以检验候选基因的SNPs位点对3个黄牛群体生长发育的遗传效应,以期发现对重要经济性状具有显著效应的遗传标记。为中国黄牛的高效选育和分子标记数据库的建立、种质资源保存与利用提供遗传学依据。本研究得到了以下结果:1.黄牛NPM1基因的克隆、鉴定及生物信息学分析利用反转录PCR（RT-PCR）技术,对牛NPM1基因进行克隆,将得到的片段重组到pGM-T载体进行序列测定。获得了一个长为885bp的cDNA片断。通过氨基酸序列分析发现,牛NPM1基因的该片段由1个外显子组成,编码295个氨基酸。与其他动物同源性比较表明,该基因与猪、犬、人、猕猴、大鼠、小鼠、原鸡和斑马鱼在氨基酸序列上分别有92.1%、91.9%、92.0%、90.7%、89.1%、88.5%、72.2%、52.8%的同源性。组织表达谱分析表明,黄牛NPM1基因在肾脏,肝脏,肺,小肠,脾脏和肌肉组织中广泛表达。2. NPM1基因SNPs检测及其与南阳牛、秦川牛和郏县红牛生长性状的关联分析运用黄牛混合DNA池测序法寻找牛NPM1基因的SNPs,在整个编码区（1个外显子:885 bp）共检测到6个SNPs和第634bp645bp之间一处12-bp的缺失突变。其中,236C>G和636A>C为错义突变,其它4个SNPs为同义突变,并且489G>A, 516G>A, 624T>C, 630T>C和636A>C 5个SNPs为连锁突变。关联分析结果显示,在南阳牛群体中,不同基因型对初生重、6月龄个体的体长、6月龄和12月龄个体胸围、12月龄个体的体重和体长、18月龄体重显著相关,突变型个体大于野生型（P<0.05）。在秦川牛群体中,不同基因型对体重、胸围、腰角宽、胸深、体高、体斜长和十字部高,共11项指标显著相关,突变型个体大于野生型（P<0.05）。在郏县红牛群体中,不同基因型对6月龄体重和平均日增重、12月龄胸围、24月龄个体坐骨端宽显著相关,突变型个体大于野生型（P<0.01或者P<0.05）。3. SREBP1c基因SNPs检测及其与南阳牛、秦川牛和郏县红牛生长性状的关联分析运用黄牛混合DNA池测序法寻找牛SREBP1c基因的SNPs,共检测到7个SNPs和内含子7区域一处84-bp的缺失突变。其中,9807G>A、10914G>A、12020 C>T和13603 T>C为4个错义突变,10781C>G为同义突变。关联分析结果显示,在南阳牛群体中,不同基因型对初生重,6、12、18月龄体重和平均日增重,24月龄体重显著相关,野生型个体大于突变型个体（P<0.05）。在秦川牛群体中,不同基因型对体重、荐高、体高、体斜长、胸围、管围、坐骨端宽、腰角宽、十字部高、胸深和胸宽显著相关,突变杂合型个体大于野生型（P<0.01或者P<0.05）。在郏县红牛群体中,不同基因型对6月龄体重、体斜长、平均日增重、胸围和坐骨端宽,12月龄体重、胸围、坐骨端宽,18和24月龄的体斜长、体重和胸围,18月龄的平均日增重显著相关,突变杂合型个体大于野生型（P<0.05）。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 基因组学与生物信息学研究领域概述
• 1.2 后基因组时代数量遗传学研究领域的概述
• 1.2.1 数量性状研究的难点
• 1.2.2 后基因组时代数量遗传学领域的挑战
• 1.3 分子育种研究概述
• 1.3.1 分子育种研究的内容
• 1.3.2 分子育种在动物育种中的应用
• 1.4 DNA 分子标记技术研究概述
• 1.4.1 DNA 分子标记的概念
• 1.4.2 DNA 分子标记的特点
• 1.4.3 DNA 分子标记技术的发展及其分类
• 1.5 候选基因SNPs 分析方法概述
• 1.5.1 SNPs 技术及其优势
• 1.5.2 本研究筛查SNPs 所采用的方法
• 1.5.3 SNPs 筛查方法研究现状及存在的问题
• 1.6 候选基因研究进展
• 1.6.1 NPM1 基因研究进展
• 1.6.2 SREBP1c 基因研究进展
• 1.7 研究的目的和意义
• 1.7.1 肉牛良种育种和牛肉市场需求
• 1.7.2 为我国肉牛分子育种提供理论依据
• 第二章 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 用于基因克隆的组织样品的来源
• 2.1.2 用于分子标记的试验动物DNA 样品的来源
• 2.1.3 试验数据的收集与整理
• 2.1.4 主要试剂和药品及其来源
• 2.1.5 溶液、缓冲液和培养基的配制
• 2.1.6 仪器设备及来源
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 候选基因的克隆
• 2.2.2 候选基因SNPs 的筛查
• 2.3 资料的统计与分析
• 2.3.1 等位基因频率和基因型频率的计算
• 2 独立性检验'>2.3.2 基因型频率的x²独立性检验
• 2.3.3 位点遗传纯合度、杂合度和有效等位基因数计算
• 2.3.4 多态信息含量计算
• 2.3.5 Hardy-Weinberg 平衡检测
• 2.3.6 遗传标记的连锁不平衡分析
• 2.3.7 遗传标记与性状的关联分析统计模型
• 第三章 黄牛NPM1 基因的克隆、鉴定及生物信息学分析
• 3.1 黄牛NPM1 基因的克隆与鉴定
• 3.1.1 总RNA 的提取与检测
• 3.1.2 黄牛NPM1 基因CDS 区的克隆与序列鉴定
• 3.1.3 不同组织表达规律
• 3.2 黄牛NPM1 基因的生物信息学分析
• 3.2.1 牛NPM1 基因与其它动物NPM1 基因CDS 序列的同源性比较
• 3.2.2 牛NPM1 基因与其它动物的氨基酸序列的遗传进化树分析
• 第四章 候选基因遗传变异检测
• 4.1 黄牛基因组DNA 样品的检测
• 4.2 黄牛NPM1 基因SNPs 检测
• 4.2.1 琼脂糖凝胶电泳检测
• 4.2.2 黄牛混合DNA 池测序分析
• 4.2.3 NPM1 基因的PCR-SSCP 检测
• 4.2.4 NPM1 基因突变的Forced PCR-RFLP 检测
• 4.2.5 NPM1 基因12bp 缺失突变的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测
• 4.3 黄牛SREBP1c 基因SNPs 检测
• 4.3.1 琼脂糖凝胶电泳检测
• 4.3.2 黄牛混合DNA 池测序分析
• 4.3.4 SREBP1c 基因突变的PCR-RFLP 检测
• 4.3.5 SREBP1c 基因突变的Forced PCR-RFLP 检测
• 4.3.6 SREBP1c 基因84bp 缺失突变的琼脂糖凝胶电泳检测
• 第五章 候选基因多态位点的群体遗传学分析
• 5.1 黄牛NPM1 基因
• G 突变位点'>5.1.1 NPM1 基因236C>G 突变位点
• A 突变位点'>5.1.2 NPM1 基因516G>A 突变位点
• 5.1.3 NPM1 基因634bp～645bp 之间12bp 缺失突变位点
• 5.2 黄牛SREBP1c 基因
• A（Exon 7）突变位点'>5.2.1 SREBP1c 基因9807G>A（Exon 7）突变位点
• 5.2.2 SREBP1c 基因9938bp～10021bp 之间84bp 缺失（Intron 7）突变位点
• G（Exon 9）突变位点'>5.2.3 SREBP1c 基因10781C>G（Exon 9）突变位点
• A（Exon 9）突变位点'>5.2.4 SREBP1c 基因10914G>A（Exon 9）突变位点
• 5.3 候选基因多态位点的连锁不平衡分析
• 5.3.1 NPM1 基因多态位点的连锁不平衡分析
• 5.3.2 SREBP1c 基因多态位点的连锁不平衡分析
• 第六章 候选基因多态性与三个黄牛品种主要生长性状关联分析
• 6.1 候选基因的SNPs 与南阳牛主要生长性状的关联分析
• 6.1.1 南阳牛群体内NPM1 基因的SNPs 与主要生长性状的关联分析
• 6.1.2 南阳牛群体内SREBP1c 基因SNPs 与主要生长性状的关联分析
• 6.2 候选基因的SNPs 与秦川牛主要生长性状的关联分析
• 6.2.1 秦川牛群体内NPM1 基因的SNPs 与主要生长性状的关联分析
• 6.2.2 秦川牛群体内SREBP1c 基因SNPs 与主要生长性状的关联分析
• 6.3 候选基因的SNPs 与郏县红牛主要生长性状的关联分析
• 6.3.1 郏县红牛群体内NPM1 基因的SNPs 与主要生长性状的关联分析
• 6.3.2 郏县红牛群体内SREBP1c 基因SNPs 与主要生长性状的关联分析
• 第七章 讨论
• 7.1 关于黄牛不同组织总RNA 的提取
• 7.1.1 关于组织样品的采集和保存
• 7.1.2 关于高质量总RNA 的提取过程与质量的控制
• 7.2 关于黄牛NPM1 基因的克隆
• 7.3 关于候选基因的多态性
• 7.3.1 关于NPM1 基因多态性
• 7.3.2 关于SREBP1c 基因多态性
• 7.4 候选基因的SNPs 与动物有关性状的关联分析
• 7.4.1 NPM1 的SNPs 与动物有关性状的关联分析
• 7.4.2 SREBP1c 的SNPs 与动物有关性状的关联分析
• 第八章 结论与创新点
• 8.1 结论
• 8.1.1 黄牛NPM1 基因的克隆、鉴定及生物信息学分析
• 8.1.2 NPM1 基因在4 个黄牛品种中的多态性分析
• 8.1.3 NPM1 基因SNPs 与3 个黄牛品种生长性状的关联分析
• 8.1.4 SREBP1c 基因在4 个牛品种中的多态性分析
• 8.1.5 SREBP1c 基因SNPs 与3 个黄牛品种生长性状的关联分析
• 8.2 创新点
• 参考文献
• 附录
• 附表
• 附图
• 缩略词
• 致谢
• 作者简介