论文摘要
目的:通过微卫星多态性分析和甲基化特异性PCR方法对p57kip2表达异常的肝癌进行p57kip2基因微卫星不稳定性（MSI）、杂合性缺失（LOH）和甲基化研究,同时在体外对肝癌细胞的CDK6和XIAP通路间的调控机制在转录及翻译水平进行研究,以期探讨和阐明肝癌发生中不同基因调控的分子机制。方法:1.人肝癌p57kip2遗传不稳定性研究:人肝细胞肝癌及癌周肝硬化各30例,正常肝组织对照30例,共90例标本,分别采用免疫组化检测P57kip2蛋白的表达,原位杂交检测p57kip2mRNA的表达。采用微卫星多态性分析进行p57kip2杂和性缺失和微卫星不稳定性的检测,10个微卫星标志覆盖了p57kip2基因所在的11p15.5到11p15.1区域,分别为D11S1397、D11S1318、D11S4046、D11S922、TH01、D11S2359、D11S1760、D11S1338、D11S569和D11S1397,PCR产物进一步做基因分型检测以证实LOH和MSI,并分析LOH和MSI与p57kip2基因mRNA和蛋白表达之间的关系。2.人肝癌p57kip2DNA甲基化研究:对人肝细胞肝癌及癌周肝组织各30例样本,采用甲基化特异性PCR（MSP）方法,检测p57kip2启动子区CpG岛的DMR-Lit1/LIT1甲基化状况,PCR阳性产物进一步作DNA测序以证实甲基化,并分析p57kip2基因甲基化与mRNA和蛋白表达之间的关系。3.人肝癌HepG2细胞系中XIAP与CDK6通路间调节机制研究:在体外利用CDK6 and XIAP siRNAs转染分别敲除人肝癌细胞系HepG2的CDK6和XIAP的mRNA表达后,通过RT-PCR和Real-time PT PCR检测mRNA表达、Western Blots检测蛋白表达,分析CDK6和XIAP两个通路间的调控关系。结果:1.人肝癌p57kip2遗传不稳定性研究:免疫组织化学检测P57kip2蛋白在正常肝组织未见表达,癌周肝硬化组与肝癌组阳性表达率均为56.67%（17/30）。P57kip2蛋白在不同分化程度的肝癌中的阳性表达率分别为:高分化组0%（0/1）,中分化组54.1%（13/24）,低分化组80%（4/5）。P57kip2蛋白表达与肝癌的分化程度有关,差异有统计学意义。原位分子杂交检测正常肝组织未见p57kip2mRNA表达,癌周肝硬化组与肝癌组阳性表达率均为26.7%（8/30）。肝癌组高分化、中分化和低分化三组阳性表达率分别为:0%（0/1）,20.8%（5/24）和60%（3/5）,三组之间p57kip2mRNA表达差异有统计学意义。癌周肝硬化组和肝癌组p57kip2mRNA和蛋白表达之间有关联性。遗传不稳定性检测结果,在10个微卫星位点中,仅有THO1（7/30,23.3%）、D11S2359（5/30,16.6%）和D11S569（1/30,3.3%）3个位点有杂合性缺失,4个位点D11S1760（3/30,10%）、D11S922（2130,6.7%）、D11S2351（4/30,13.3%）和D11S569（1/30,3.3%）有微卫星不稳定表现。p57kip2mRNA和蛋白表达缺失主要与TH01位点的LOH和D11SD11S1760的MSI相关。2.人肝癌p57kip2DNA甲基化研究:在30例肝癌组织标本中检测到6例p57kip2启动子甲基化,甲基化率为20%（6/30）,而30例癌周肝硬化的p57kip2基因没有检测到甲基化。但p57kip2启动子区甲基化与p57kip2mRNA和蛋白表达缺失没有关联性。3.人肝癌HepG2细胞系中XIAP与CDK6通路间调节机制研究:XIAP siRNA在沉默XIAP mRNA表达的同时,也能够明显降低CDK6mRNA的表达。但XIAP mRNA的表达在CDK6 siRNA转染组并未受到明显影响。CDK6 siRNA转染HepG2后CDK6蛋白表达明显降低,并在MG132处理后明显在表达,XIAP蛋白的表达亦未受到CDK6siRNA的明显影响。结论:1.p57kip2mRNA和蛋白表达异常提示其可能在原发性肝癌的发生发展中起重要作用,但p57kip2在肝癌中是否是具有抑癌基因生物学特性需要进一步研究证实。（1）与p57kip2基因同一区域的10个微卫星位点不是p57kip2基因LOH和MSI的频发位点;p57kip2 mRNA和蛋白表达缺失主要与TH01位点的LOH和D11SD11S1760的MSI相关。（2） p57kip2基因启动子区甲基化可能不是导致p57kip2 mRAN和蛋白表达缺失的原因。2.首次证实人肝癌CDK6和XIAP通路之间存在调节关系,XIAP siRNA可明显降低CDK6mRNA的表达,但CDK6 siRNA并不影响XIAP mRNA和蛋白的表达,具体的调节机制值得进一步研究。
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