串联亲和纯化与质谱技术对Mde4、Swi5、Sfr1蛋白复合物的鉴定

论文摘要

细胞分裂过程中,染色体的正确分离得以将遗传物质精确地、均等地分配给两个子细胞。不正确的染色体分离会导致癌症的发生及先天性基因缺陷性疾病,如Down Syndrome就是由于多余的21号染色体拷贝。染色体分离这一复杂生物学进程是如何被精确而有序的调控的,其调控的具体分子机理一直以来都是生物医学研究者们的热衷问题。最近的研究显示,Mde4（SPBC6B1.04）、Swi5（SPBC409.03）及Sfr1（SPBC28F2.07）蛋白在染色体分离过程中发挥重要作用,但其蛋白复合物构成及调节机制仍然不清。在本实验中,我们开发了一种新的基于大片段同源基因重组的蛋白标记技术,即在Mde4、Swi5、Sfr1靶基因终止密码子上、下游临近区域设计引物,扩增出长度大约219-500bp左右的片段,并在片段两端引入酶切位点,从而将它克隆入我们所构建的含抗G418基因及TAP标记基因的pTAPKan1质粒载体中。重组质粒转化入酵母后,克隆PCR证实了我们的标记方法具有重组效率高及特异性好的特点。进一步的Western blot证实,所标记的TAP蛋白呈正常表达,经过两步串联亲和纯化后,蛋白银染色结果证实所纯化的蛋白样品以高纯度蛋白复合物形式存在。结合最新的质谱分析技术,我们在正常生理水平上对上述三种蛋白复合物进行蛋白质组学分析,研究不仅证实了已知的Swi5-Swi2及Swi5-Sfr1蛋白复合物的存在,而且发现了新的Mde4及Swi5作用蛋白,分别为Dnt1及Sir2蛋白,尽管其确切功能尚有待于发现,但有理由相信,这两种蛋白在染色体分离的调控过程中发挥着重要作用。进一步的磷酸化蛋白质组学技术证实在Swi5及Sfr1蛋白均存在着磷酸化位点。Swi5在第72号丝氨酸被磷酸化,而Sfr1包含有3个磷酸化位点（丝氨酸26, 109和165）。

论文目录

• 提要
• 第一篇 前言
• 第二篇 文献综述
• 第一章 粘附素（COHESIN）、凝集素（CONDENSIN）、分离酶（SEPARASE）及AURORA激酶等对染色体分离的调节
• 1 染色体的粘着
• 2 染色体的凝集
• 3 分离酶及其活性调控
• 4 姐妹染色体的双向定位
• 5 姐妹染色体分离的调节
• 6 减数分裂过程中染色体的分离
• 第二章 有丝分裂纺缍体
• 1 纺缍体装配的分子机制
• 第三章 细胞分裂过程中的同源重组及其与染色体分离的关系
• 1 减数分裂过程中rec 基因的表达
• 2 减数分裂时的同源重组
• 3 姐妹染色体的粘附，重组和分离
• 4 无同源基因重组发生的减数分裂期染色体分离
• 第四章 染色体不稳定性与肿瘤的关系
• 第三篇 实验研究
• 第一章 MDE4（SPBC681.04）、SW15（SPBC409.03）、SFR１（SPBC28F2.07）融合蛋白的构建
• 1 实验材料
• 1.1 设备
• 1.2 试剂
• 1.3 菌株
• 1.4 培养基
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 3.1 pTAPKan1 质粒的构建
• 3.2 Mde4、Swi5、Sfr1终止密码子上、下游基因的扩增
• 3.3 Mde4、Swi5、Sfr1终止密码子上、下游基因的连接
• 3.4 Mde4、Swi5、Sfr1重组质粒的构建
• 3.5 克隆PCR 证实Mde4、Swi5、Sfr1在C 末端标记TAP
• 4 讨论
• 第二章 MDE4、SWI5、SFR1 蛋白纯化及质谱分析
• 1 实验材料
• 1.1 设备
• 1.2 培养基
• 1.3 主要试剂
• 2 实验方法
• 2.1 Western Blot 检测转染后TAP 标记蛋白表达情况
• 2.2 Mde4、Swi5、Sfr1 蛋白纯化
• 2.3 质谱分析
• 2.4 蛋白质组学分析
• 3 结果
• 4 讨论
• 第四篇 结论
• 课题创新性总结
• 参考文献
• 附录
• 攻读博士期间发表的论文及获奖情况
• 致谢
• 中文摘要
• ABSTRACT