全细胞直接注射法生产牛克隆胚胎的研究

论文摘要

在哺乳动物体细胞核移植研究中,克隆胚胎的构建主要有两种方法:电融合法和直接注射法。传统的电融合法虽然操作简便,重复性强,但是因为其融合率相对较低,仪器设备昂贵,操作时间长等缺陷而限制了它的大范围推广。相对于电融合法而言,胞质内直接注射法对卵母细胞和供体核的操作快速有效,减轻了对受体和供体的损伤,同时将供体细胞质对重构胚发育的影响降低到最低程度。已知获得克隆后代的供体细胞类型中,卵丘细胞和颗粒细胞的核移植效率比较理想。本文以这两种体细胞为供体对全细胞直接注射法克隆的一些因素进行研究。本研究主要研究结果如下:试验1.在两种不同去核方法的比较实验中,将改良的Willadesn去核法（点压法）与盲吸去核法的去核效率进行了比较。虽然两种去核方法的去核效率（65.57%和68.8%,P＞0.05）没有显著差异,但是点压法操作简便,去核时间短。试验2.为了确定最佳的牛重构胚激活方法,将体外成熟的牛卵母细胞经5μmol/L Ionophore、CH、Ionophhore+6-DMAP 3种不同的激活方法激活,然后在mSOF内培养,24h后各组之间卵裂率没有显著差异（49.27%、48.02%和53.59%,P＜0.05）;培养7d后,孤雌激活卵母细胞在Ionophore+6-DMAP组的囊胚率显著高于Ionophore组和CH组（46.31%、26.55%和27.75%）,Ionophore组和CH组的囊胚率之间没有显著差异（P＞0.05）。试验3.在确定供体细胞类型对核移植影响的实验中,以新鲜卵丘细胞、原代卵丘细胞和第3代颗粒细胞为供体进行核移植。实验结果显示新鲜卵丘细胞组、原代卵丘细胞组和第3代颗粒细胞组的卵裂率之间没有显著差异（38.18%、41.35%和39.86%,P＞0.05）。新鲜卵丘细胞组、原代卵丘细胞组和第3代颗粒细胞组的囊胚率Ⅰ之间没有显著差异（38.10%、39.62%和40.35%,P＞0.05）。新鲜卵丘细胞组、原代卵丘细胞组和第3代颗粒细胞组的囊胚率Ⅱ之间没有显著差异（15.46%、16.41%和16.08%,P＞0.05）。试验4.在研究不同处理供体细胞的试验中,以血清饥饿3天的原代卵丘细胞、汇合3d的原代卵丘细胞和汇合4d的原代卵丘细胞为供体进行核移植。研究结果显示各组之间的卵裂率（分别为:41.97%、41.35%和39.69%）和囊胚率Ⅰ（31.15%、32.83%和34.61%）以及囊胚率Ⅱ（12.93%、13.58%和13.74）之间都没有显著差异（P＞0.05）。表明完全融合的细胞经适当体外培养后可以获得较高的囊胚率,血清饥饿对牛重构胚的发育不是必需的。试验5.在研究注核与激活间时间间隔对重构胚发育影响的研究中,采用了注核后立即激活,注核3h后激活和注核4h后激活3种不同的激活策略对牛重构胚进行激活,然后转移到mSOF中进行培养7d并统计卵裂率和囊胚率。实验结果表明培养24h后立即激活组的卵裂率（27.83%）显著低于注核3h后激活组和注核4h后激活组的卵裂率（33.93%和35.46%,P＜0.05）,培养7d后立即激活组的囊胚率（31.25%）显著低于注核3h后激活组和注核4h后激活组（36.84%和38.00%,P＜0.05）;Ⅱ组和Ⅲ组之间的卵裂率和囊胚率之间都没有显著差别。实验结果说明延迟激活有利于重构胚的发育,可以提高克隆效率。试验6.为了研究不同培养液对牛重构胚发育的影响,本研究采用了CR1 aa、mSOF和mSOF+FBS 3种培养液对牛重构胚进行体外培养。3个培养体系都采用卵丘细胞共培养。实验结果表明,研究结果显示mSOF组（39.52%）和mSOF+FBS组的卵裂率（40.96%）显著高于CR1aa组的卵裂率（33.17%）,mSOF+FBS组和mSOF组之间卵裂率没有显著差异（P＞0.05）。mSOF+FBS组的囊胚率Ⅰ（36.76%）和mSOF组的囊胚率Ⅰ（36.36%）也显著高于CR1aa组的囊胚率Ⅰ（31.34%,P＜0.05）。mSOF+FBS组的囊胚率Ⅱ（36.76%）和mSOF组的囊胚率Ⅱ（36.36%）也显著高于CR1aa组的囊胚率Ⅱ（31.34%,P＜0.05）。实验结果说明培养液类型对重构胚的发育有影响,并且血清的添加有利于哺乳动物重构胚胎的发育。试验7.本研究对胞质内直接注射法克隆各步骤中卵母细胞的存活率进行了分析。通过分析发现在胞质内直接注射克隆中,注核过程对重构胚的构建起到重要作用,理想的内径的注核针可以获得接近50%的重构胚。在牛中,胞质内直接注射法克隆的去核针的内径为20μm。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 前言
• 1.文献综述
• 1.1 体细胞核移植发展简史与现状
• 1.2 牛体细胞核移植的研究进展
• 1.3 胞质内直接注射法研究的进展
• 1.4 哺乳动物核移植应用的前景
• 1.4.1 在基础生物学研究领域的应用
• 1.4.2 体细胞核移植在畜牧业及珍稀濒危动物保护中的作用
• 1.4.3 在转基因动物和医学领域的的应用
• 1.5 体细胞核移植存在的主要问题
• 1.5.1 核移植总体效率太低
• 1.5.2 流产率高,产仔率低
• 1.5.3 出生动物死亡率高
• 2.研究目的与意义
• 3.试验材料与方法
• 3.1 试验设备
• 3.2 主要试剂
• 3.3 显微操作用针的制作与储存
• 3.3.1 注核/去核针的制备
• 3.3.2 固定针的制备
• 3.3.3 固定针和去/注核针的保存
• 3.4 操作液
• 3.4.1 供体细胞培养液系列
• 3.4.2 卵母细胞培养液系列
• 3.4.3 胚胎培养液系列
• 3.5 受体卵母细胞的制备
• 3.5.1 卵巢的收集与保存
• 3.5.2 卵母细胞采集
• 3.5.3 卵母细胞的筛选与分级
• 3.5.4 卵母细胞成熟培养
• 3.5.5 共培养细胞单层的制备
• 3.5.6 卵母细胞成熟判定
• 3.6 供体细胞的制备与处理
• 3.6.1 卵丘细胞系的建立
• 3.6.2 卵丘细胞的传代
• 3.6.3 卵丘细胞的冻存
• 3.6.4 卵丘细胞的解冻
• 3.6.5 颗粒细胞的建系、传代、冻存与解冻
• 3.7 卵母细胞的处理
• 3.7.1 卵母细胞的去核
• 3.7.2 去核效率的鉴定
• 3.7.3 重构胚的构建
• 3.7.4 重构胚的激活
• 3.7.5 重构胚胎的培养
• 3.8 试验方案
• 3.9 试验设计
• 3.10 统计学分析
• 4.结果与分析
• 4.1 不同去核方法对牛卵母细胞去核成功率的影响
• 4.2 不同的激活剂对牛卵母细胞孤雌激活的影响
• 4.3 不同类型供体细胞对SCNT重构胚发育潜能的影响
• 4.4 不同处理的供体细胞对牛SCNT重构胚发育潜能的影响
• 4.5 不同的激活方法对牛重构胚发育能力的影响的研究
• 4.6 不同的培养体系对牛重构胚胎体外发育的影响
• 4.7 显微操作后卵母细胞的存活率
• 表3不同去核方法对牛卵母细胞去核成功率的影响
• 5.讨论
• 5.1 不同去核方法对牛卵母细胞去核成功率的影响
• 5.2 不同的激活剂对牛卵母细胞孤雌激活的影响
• 5.3 不同类型供体细胞对牛SCNT重构胚的影响
• 5.4 不同处理的供体细胞对牛SCNT重构胚发育潜能的影响
• 5.5 不同的激活方法对牛重构胚发育能力的影响的研究
• 5.6 不同的培养体系对牛重构胚胎体外发育的影响
• 5.7 显微操作对卵母细胞存活率的影响
• 6.结论
• 7.创新点与特色
• 参考文献
• 致谢
• 附图