细菌的酶解法制备人参稀有皂苷的研究

论文摘要

人参皂苷Rg3具有抗癌抗肿瘤的功效,有极高药用价值和应用前景。但Rg3只是红参中的特有皂苷,且含量仅为十万分之三,制备工艺复杂,耗资巨大,所以,直接提取不符合实际。而人参中含量较高的人参二醇类皂苷Ra1、Ra2、Ra3、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、F2与稀有人参皂苷Rg3分子结构中皂苷元相同,只是糖基不同,所以人参二醇类皂苷转化法制备稀有人参皂苷Rg3具有现实意义。为得到把人参二醇类皂苷转化为Rg3的特种人参皂苷糖苷酶,本实验对韩国Kaist提供的20种细菌进行了筛选。选定Arthrobacter sp.3、Rhodopseudomonas sp.18。确定sp.3菌的发酵条件为:25℃;二号培养基;浓度为0.02%的芦丁为酶的诱导物;发酵时间为48h;sp.GS3082菌的发酵条件为:30℃;二号培养基;浓度为0.02%的芦丁为酶的诱导物;发酵时间为80h;建立发酵曲线,sp.3菌悬液接入发酵培养基后6h进入对数生长期,在32h时达到生长的高峰期,在32～40h时为生长的相对稳定期,自40h后进入生长的衰亡期,酶活36h时达到最高,转化率达40%;sp.18菌悬液接入发酵培养基后44h进入对数生长期,在72h时达到生长的高峰期;在72～84h时为生长的相对稳定期,自84h后进入生长的衰亡期。酶活82h时达到最高,转化率达33%。两种菌将人参二醇类皂苷PPD糖基水解,反应较彻底,主要产稀有人参皂苷Rg3、Rh2和苷元等;sp.3菌所产酶酶活较高,底物的40%可转化为人参稀有皂苷Rg3,而sp.18菌为33%。采用DEAE蛋白分离方法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对酶进行分离提纯,并确定其分子量。sp.3菌:第33、34管酶蛋白在SDS-聚丙烯酰胺电泳凝胶中为单带,酶蛋白纯度很高,初步认定其为纯酶。且分子量约为64 KDa;sp.18菌:第18管酶蛋白在SDS-聚丙烯酰胺电泳凝胶中呈两条带,说明并未分离出纯酶,有待进一步分离提纯。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 人参
• 1.1.1 人参的种类
• 1.1.2 人参的形态
• 1.1.3 人参的生长环境
• 1.1.4 人参的化学成分
• 1.2 人参皂甙
• 1.2.1 人参皂甙的分类及结构
• 1.2.2 人参中人参皂苷的含量
• 1.2.3 人参皂甙药理作用
• 1.2.4 人参皂甙Rg3药理作用
• 1.2.5 人参皂苷的结构改造
• 1.2.6 人参皂甙的分离及分析方法
• 1.2.7 本论文的主要研究内容
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 实验材料的制备
• 2.2.2 菌种发酵条件的确定方法
• 2.2.3 薄层层析（TLC）法
• 2.2.4 发酵曲线的绘制
• 2.2.5 DEAE-Cellulose （DE52）离子交换层析
• 2.2.6 酶分子量的测定
• 2.2.7 高效液相色谱（HPLC）纯度分析
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 菌种的筛选
• 3.2 发酵条件的确定
• 3.2.1 培养基的确定
• 3.2.2 酶的诱导物的确定
• 3.2.3 发酵温度确定
• 3.2.4 发酵时间确定
• 3.2.5 发酵曲线
• 3.2.6 HPLC产物分析
• 3.3 酶的分离纯化
• 3.3.1 酶的分离及活力检测
• 3.3.2 酶分子量的测定
• 3.3.3 酶反应
• 结论
• 参考文献
• 致谢