论文摘要
目的:（1）运用生物信息学手段获取OLC1基因相关信息;（2）运用有限稀释法筛选得到稳定过表达OLC1的H1299（大细胞肺癌）细胞株。为深入研究OLC1在诱导细胞发生癌变中的作用,我们对H1299-OLC1细胞株实施生长速度的测定实验,平板集落形成实验,不同时段细胞周期检测等系列实验,即进行将OLC1作为候选原癌基因的功能研究;（3）以H1299—OLC1为细胞模型,OLC1作为候选药物靶标,筛选1180种药物小分子化合物,初步建立小分子化合物的药物筛选平台。（4）以OLC1为药物靶标,研究4种抗癌药物和新疆阿魏菇提取物对肺癌细胞的影响。方法: （1）通过生物信息学方法,利用在线数据库和分析软件分析、预测OLC1基因的染色体定位、编码氨基酸序列、结构域、同源序列等信息;（2）OLC1稳定株的筛选、鉴定及功能研究:应用有限稀释法筛选H1299-OLC1稳定株;Western Blotting检测OLC1蛋白的表达;新候选原癌基因OLC1的功能研究:MTS细胞增殖实验检测H1299-OLC1细胞、空载体细胞H1299-pcDB、亲本细胞H1299的生长情况;平板集落形成实验测定H1299—OLC1与对照H1299-pcDB的细胞独立生长情况及形成集落数目;采用流式细胞术观察处于对数生长期H1299-OLC1、H1299-pcDB细胞贴壁培养后24小时、48小时、72小时细胞周期变化情况。（3）以OLC1为靶标的1180种候选药物小分子化合物的筛选:采用钙黄绿素为荧光探针,应用荧光比色法,荧光记数仪GENios Pro reader（Tecan）检测。绿色荧光强度值在535nm处检测,激发波长484nm。通过倒置荧光显微镜观察细胞的形态变化;（4）OLC1为靶标的药敏试验:MTS细胞增殖实验检测4种抗癌药物和新疆阿魏菇粗提物对H1299-OLC1细胞增殖的影响。结果:（1）通过生物信息学分析,确定OLC1基因定位于16q22.3,CDS区编码364个氨基酸,无跨膜区,无明显信号肽序列。亚细胞定位为,细胞核:56.5%,细胞质:30.4%,线粒体:13.0%。有两个保守结构域分别为DUF292区（位于33-139氨基酸）和脯氨酸富集区（位于220-278氨基酸）。在许多类型的肿瘤细胞和肿瘤组织中都有分布;（2）稳定表达OLC1的H1299单克隆细胞株均表现出转化细胞的特性:MTS细胞增殖实验显示,H1299-OLC1细胞株生长速度明显快于对照空载体细胞H1299-pcDB（P<0.05）;平板集落形成克隆数明显多于空载体稳定株（P<0.05）;细胞周期检测显示H1299-OLC1细胞周期变化中G1期细胞所占比例显著高于空载体细胞,而且在24小时到72小时时,增幅大大高于空载体细胞株（P<0.05）;（3）建立以钙黄绿素为荧光探针的小分子化合物筛选平台,初筛获取6种候选药物;（4）H1299-OLC1稳定株有较强的抗药性（;5）新疆阿魏菇提取物能有效抑制H1299-OLC1稳定株的增殖。结论:（1）生物信息学分析发现OLC1在多种组织和肿瘤细胞中分布,具有特殊保守域结构及功能位点,提示其可能具有重要功能;（2）利用有限稀释法进行单克隆稳定株的筛选,得到稳定过表达OLC1的H1299单克隆细胞株模型;（3）体外系列试验证明OLC1能使H1299细胞进一步发生恶性转化,提示OLC1具有原癌基因的属性。（4）建立以钙黄绿素为荧光探针,荧光记数仪与显微镜荧光和明场检测相结合的,候选药物小分子化合物针对特定基因作为药物靶标筛选平台;（5）初步筛选发现6种候选药物小分子化合物;（6）OLC1过表达稳定株的耐药性高于对照空载体稳定株;（7）低浓度的新疆地产阿魏菇醇提物（2.5%）能显著抑制H1299-OLC1的增殖,但对H1299-pcDB空载体稳定株却没有明显抑制作用。