RNA干扰抑制人结肠癌HT-29细胞COX-2基因表达的实验研究

论文摘要

第一部分人COX-2小分子干扰RNA的设计、合成及转染条件的优化目的设计并化学合成人COX-2基因的小分子干扰RNA,并进一步优化转染人结肠癌HT-29细胞的条件。方法遵循RNA干扰目标序列的选取原则,利用互联网资源对人COX-2基因mRNA序列设计4条小干扰RNA（siRNA）,经退火合成。以阴性荧光素特异性siRNA为报告基因,通过脂质体lipofectamineTM2000转染人结肠癌HT-29细胞,利用荧光显微镜计数观察转染效率,MTT法检测转染后对HT-29细胞的毒性。结果成功设计并合成4对人COX-2基因的小分子干扰RNA,在24孔板中筛选出最优化的转染条件为1.5ul lipofectamineTM2000和40pmol siRNA。结论成功设计并合成了人COX-2基因的小分子干扰RNA,同时优化的最佳转染条件为进一步研究人COX-2小干扰RNA功能提供了条件。第二部分COX-2小干扰RNA对人结肠癌HT-29细胞COX-2表达及细胞生长影响的研究目的研究COX-2 siRNA对环氧合酶-2（COX-2）高表达的人结肠癌HT-29细胞增殖和凋亡的影响。方法从化学合成的4对小干扰RNA中筛选出最佳的靶向COX-2 siRNA转染人结肠癌HT-29细胞,采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western印迹分别从mRNA和蛋白水平检测COX-2表达,四甲基偶氮唑蓝（MTT）和Hoechst染色检测COX-2表达被抑制后细胞增殖和凋亡的情况。结果COX-2 siRNA能在mRNA和蛋白水平上下调人结肠癌HT-29细胞中COX-2基因的表达（P<0.05）,以转染72h时显著。COX-2表达被抑制后,HT-29细胞生长受到明显抑制（P<0.05）,凋亡细胞显著增加。结论COX-2与结肠癌细胞生长和凋亡密切相关,抑制结肠癌细胞中COX-2表达可以抑制结肠癌细胞生长,促进结肠癌细胞凋亡。第三部分人COX-2shRNA真核表达载体的构建、鉴定和转染条件的优化目的构建环氧合酶-2（COX-2）基因靶向性的shRNA真核表达载体,并进一步优化在转染人结肠癌HT-29的转染条件,以观察转染结肠癌细胞株HT-29细胞后,其对COX-2活性的抑制效率。方法设计短发夹结构的COX-2 siRNA对应模版DNA序列,退火处理后克隆至pGPH1-GFP-Neo质粒,构建重组质粒pshCOX-2。酶切并测序鉴定。优化转染条件后,将重组质粒转染人结肠癌HT-29细胞,采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、Western印迹分别从mRNA和蛋白水平检测COX-2表达。结果pshCOX-2经鉴定与设计目的序列完全一致。转染重组质粒72h后可以显著抑制HT-29细胞COX-2 mRNA表达与对照组比较有显著性差异（F=349.58,P=0.0001）,对照组之间则无差异（P>0.05）,蛋白水平的抑制效率与mRNA水平一致。结论成功构建无内毒素活性的COX-2 shRNA真核表达质粒pshCOX-2,可稳定抑制人结肠癌HT-29细胞COX-2基因表达,为利用RNAi技术在体内和体外水平研究COX-2在结肠癌中的作用机制打下了基础。第四部分抑制COX-2蛋白表达对人结肠癌HT-29细胞生物学活性的影响目的体外观察pshCOX-2抑制COX-2活性对HT-29细胞生物学活性的影响,并探讨可能的作用机制。方法应用pshCOX-2瞬时转染HT-29细胞,MTT法检测细胞的生长曲线,放射免疫法（RIA）和ELISA法分别检测转染后细胞培养上清中PGE2和VEGF的表达;优化G418浓度、筛选和鉴定稳定表达pshCOX-2的HT-29细胞株,应用过河实验观察细胞迁徙能力的改变,集落形成实验观察细胞增殖能力的改变。免疫组化法观察稳定细胞株中COX-2和EGFR的表达,采用RT-PCR检测稳定细胞株中VEGF、MMP-2、EGFR mRNA的表达。结果pshCOX-2转染HT-29后72h,细胞增长明显受抑,细胞培养上清中PGE2和VEGF的表达明显下降。稳定表达pshCOX-2细胞株内COX-2蛋白和mRNA均下调,细胞越过划痕的时间为（7.67±1.53）d,与对照组有显著性差异（F=9.50,P=0.0138）;细胞集落密度为（257.67±39.53）个,明显低于其平行对照组（F=37.07,P=0.0004）。免疫组化提示pshCOX-2细胞株内COX-2和EGFR表达均有下调,RT-PCR显示pshCOX-2组VEGF、MMP-2、EGFR mRNA表达下调。结论抑制COX-2活性能抑制HT-29细胞增殖和迁徙能力,同时可以抑制VEGF、EGFR、MMP-2表达和PGE2产生,有潜在的抑制肿瘤血管形成作用。第五部分抑制COX-2蛋白对结肠癌细胞凋亡影响的实验研究目的观察pshCOX-2抑制COX-2活性对HT-29细胞凋亡和对于化疗药物敏感性的影响,并探讨可能的作用机制。方法应用pshCOX-2瞬时转染HT-29细胞,联合使用5-Fu处理HT-29细胞,MTT法检测细胞的生长曲线,流式细胞仪分析凋亡率。应用TUNEL法观察稳定表达pshCOX-2的HT-29细胞凋亡形态,应用RT-PCR和Western blot法从转录水平和蛋白水平检测Bcl-2/Bax和Fas/FasL表达的变化。结果pshCOX-2瞬时转染3d后可以明显抑制HT-29细胞生长,与空白和阴性对照相比（P<0.05）,联合使用5-Fu后在7d时细胞生长受抑作用,且呈协同作用,差异有显著性（F=231.94,P=0.0001）。流式细胞仪检测细胞DNA含量,发现转染组凋亡指数（7.07%）明显高于对照组的0.30%和0.27%（F=24.71,P=0.0013）,低于联合处理组13.57%,差异有显著性（P<0.05）。TUNEL法原位凋亡指数结果与流式细胞仪结果类似,RT-PCR和Western blot结果提示稳定表达pshCOX-2细胞株Bax和Fas表达上调,Bcl-2表达呈下调趋势,而FasL表达与对照组相无显著性差异（P<0.05）。结论COX-2shRNA可以抑制细胞增殖,促进凋亡,增强肿瘤细胞对5-Fu的敏感性,COX-2shRNA促进凋亡的机制可能与上调Bax和Fas表达,下调Bcl-2表达有关。第六部分荷瘤鼠模型建立及COX-2shRNA对结肠癌细胞致瘤性的影响目的通过裸鼠体内实验,进一步验证抑制COX-2表达对结肠癌致瘤的影响并探讨可能的作用机制。方法选用BALB/C裸鼠进行体内实验。裸鼠25只。随机分为5组:A.空白对照组5只;B.阴性质粒组5只;C.转染pshCOX-2组5只;D.5-Fu处理组5只;E.5-Fu+转染pshCOX-2联合组5只。于每只裸鼠右胁腹前肢皮下分别接种等量的不同转染细胞（5×106个细胞/100ul/只）,接种42d后处死老鼠。观察肿瘤生长状况、成瘤潜伏期,计算抑瘤率。免疫组化法检测瘤组织内COX-2和EGFR蛋白表达情况,测定瘤块中MVD;TUNEL法检测肿瘤的凋亡指数,透视电镜观察瘤块中肿瘤细胞凋亡情况。结果转染pshRNA组成瘤潜伏期延长、生长曲线、瘤体积和瘤重与对照组比较（P均<0.05）,联合治疗组抑瘤作用更强,与转染pshRNA组相比较（P均<0.05）;pshRNA组原位凋亡明显增多,透视电镜观察pshRNA组出现较多明显凋亡形态的细胞。免疫组化提示pshRNA组COX-2和EGFR表达均较对照组下调（P<0.05）,瘤组织中MVD,对照组明显高于pshRNA组（P<0.05）。结论体内实验表明抑制肿瘤细胞COX-2表达可以有效抑制肿瘤的生长,促进凋亡,抑制肿瘤血管形成,同时可以增加肿瘤细胞对化疗药物敏感性,以此基因为靶点进行的小干扰RNA基因治疗,将有可能成为人类结肠癌治疗提供有效的手段。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 人COX-2siRNA 的设计、合成及转染条件的优化
• 一、siRNA 的设计、合成
• （一） 方法
• 二、siRNA 转染条件的优化
• （一） 材料
• （二） 方法
• （三） 结果
• （四） 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 第二部分 COX-2 小干扰RNA 对人结肠癌HT-29 细胞COX-2 表达及细胞生长影响的研究
• （一） 材料
• （二） 方法
• （三） 结果
• （四） 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第三部分 人COX-2shRNA 真核表达载体的构建、鉴定、转染条件的优化
• 一、人COX-2shRNA 真核表达载体的构建、鉴定
• （一） 材料
• （二） 方法
• （三） 结果
• 二、真核表达质粒载体转染条件的优化
• （一） 材料
• （二） 方法
• （三） 结果
• 三、真核表达质粒载体功能的鉴定
• （一） 材料
• （二） 方法
• （三） 结果
• （四） 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第四部分 COX-2 静默对人结肠癌HT-29 细胞生物学的影响
• （一） 材料
• （二） 方法
• （三） 结果
• （四） 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第五部分 抑制COX-2 蛋白对促进结肠癌细胞凋亡的实验研究
• （一） 材料
• （二） 方法
• （三） 结果
• （四） 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第六部分 荷瘤鼠模型建立及COX-shRNA 对结肠癌细胞致瘤性的影响
• （一） 材料
• （二） 方法
• （三） 结果
• （四） 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 博士研究生期间发表和待发表的文章
• 英文缩略词表
• 致谢