论文摘要
喹诺酮是一类合成抗生素类药物,英文名称:quinolones(QNs)。在化学上与萘啶酮酸相关,其作用机理是直接作用于细菌的核、抑制细菌的DNA旋转酶,使酶不能在DNA双链上引入切口,破坏细菌的代谢和繁殖,迅速杀灭细菌。最初这类药物用于治疗尿道感染,现在已发展到治疗系统感染疾病,并且在动物饲养中作为预防和治疗药物普遍使用。近年来,这些药物在动物组织中的残留已引起广泛的注意。通过将诺氟沙星烷基化合成诺氟沙星衍生物,经过紫外、液质以及核磁共振检测后,采用戊二醛法分别与BSA和OVA偶联。再利用活化酯法将五种喹诺酮药物直接与BSA和OVA偶联。经紫外鉴定,半抗原与蛋白质的偶联均成功。分别免疫兔子,制备多克隆抗体,经筛选,效价为102400的诺氟沙星衍生物的抗血清较好。以此抗血清为基础,初步建立了基于多克隆抗体的间接ELISA方法,来检测QNs。并通过改变相关的物理、化学影响因素,例如:包括包被溶液、抗体稀释液、封闭液、竞争时间、抗体与标准溶液的体积比等,对ELISA方法进行优化,进而在ELISA条件下获得更好的结果。优化后,最终得到标准曲线,检测限(IC90)为0.0126 ng/mL、半数抑制量(IC50)为0.54 ng/mL和检测范围(IC20～IC80)为0.04467～14 ng/mL。此外,还从方法的特异性、准确性、灵敏度来评估了本ELISA方法。回收率分别是63%～95%,变异系数小于20%。除与5种QNs的交叉反应低于5%外,其余13种QNs分别在16%和112%之间,符合多残留ELISA方法检测的要求。同时建立了猪肉和鱼肉中MAR、ENO、OFL、PEF、NOR、CIP、LOM、DAN、ENR、SAR、DIF、OXO、FLU等等19种QNs的HPLC–ESI–MS/MS确证测定方法。本方法通过添加回收试验,变异系数测定,表明本方法完全符合目前国内国际上对动物性食品中兽药残留确证要求。
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摘要ABSTRACT第一章 绪论1.1 喹诺酮类抗生素概论1.1.1 喹诺酮类抗生素的理化性质1.1.2 喹诺酮类抗生素药理性质1.2 喹诺酮类抗生素的残留与危害1.3 喹诺酮类抗生素残留的分析检测技术1.3.1 仪器分析法1.3.2 免疫分析方法1.4 本课题研究内容、目标1.4.1 研究内容1.4.2 研究目标第二章 喹诺酮类抗生素免疫原的合成2.1 实验材料2.1.1 试剂2.1.2 主要仪器设备2.2 实验方法2.2.1 5 种喹诺酮抗生素免疫原及包被原的合成2.2.2 诺氟沙星衍生物的合成及其免疫原、包被原的合成2.2.3 各种免疫原的鉴定2.3 实验结果2.3.1 诺氟沙星衍生物的鉴定2.3.2 各种免疫原的蛋白含量的测定2.3.3 各种免疫原偶联比的测定2.4 讨论2.4.1 分析药物的结构2.4.2 设计合成的原则2.4.3 “间隔臂”2.4.4 载体的选择2.4.5 交联方法的选择2.4.6 最佳交联数目2.5 本章小结第三章 喹诺酮类抗生素多克隆抗体的制备与鉴定3.1 实验材料3.1.1 试剂3.1.2 主要溶液3.1.3 主要仪器设备3.2 实验方法3.2.1 抗血清的制备3.2.2 抗血清的分离3.2.3 工作浓度的确定及血清效价的测定3.2.4 抗血清的筛选3.3 实验结果3.3.1 抗血清的效价3.3.2 粗测抗血清的抑制率及交叉反应3.4 讨论3.4.1 动物的选择3.4.2 免疫剂量、时间和途径3.4.3 动物采血法3.5 本章小结第四章 间接ELISA 检测方法的建立与优化4.1 实验材料4.1.1 试剂4.1.2 主要溶液4.1.3 主要仪器设备4.2 实验方法4.2.1 抗血清的纯化4.2.2 工作浓度的确定4.2.3 竞争ELISA 标准曲线的制作4.2.4 间接ELISA 方法的优化4.2.5 间接ELISA 方法的评估4.3 实验结果4.3.1 工作浓度的确定4.3.2 竞争曲线的制作4.3.3 间接ELISA 方法的优化4.3.4 间接ELISA 方法的评估4.4 讨论4.4.1 ELISA 方法的影响因素4.4.2 ELISA 方法的评估4.5 本章小结第五章 喹诺酮类多残留HPLC–ESI–MS/MS 检测方法的确证5.1 实验材料5.1.1 标准品5.1.2 主要仪器设备5.1.3 主要试剂与材料5.2 实验方法5.2.1 样品的前处理5.2.2 检测条件的设置5.2.3 标准曲线的绘制5.2.4 检测限的测定5.2.5 准确度、精密度、重复性的测定5.3 试验结果5.3.1 标准色谱图及质谱棒状图5.3.2 标准曲线5.3.3 准确度、精密度、重复性的测定5.4 讨论5.4.1 MS/MS 检测方式的选择5.4.2 样品处理条件的优化5.4.3 流动相溶液的选择5.4.4 准曲线、线性范围和检出限5.4.5 回收率和精密度5.5 小结总结致谢参考文献攻读硕士学位期间学术成果清单
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