小鼠4细胞胚胎密闭培养体系的建立及胚胎密闭培养条件筛选研究

论文摘要

作为空间生命科学重要研究内容之一,胚胎的空间发育研究一直受到国内外研究者的高度关注。但是目前所普遍采用的开放式胚胎培养体系无法在真空、失重的环境中支持早期胚胎的体外发育,因此必须选用密闭培养的方式（包括气密和液密）进行胚胎空间密闭培养。胚胎密闭培养就是在胚胎培养前预先向胚胎培养液中充入含有一定比例O2,CO2和N2的标准气以提供胚胎发育的气相支持。同时,由于密闭培养的特殊性,在胚胎发育的过程中无法向体系中补充更新营养与气相成分,因此适宜的胚胎培养密度对体系能否更长时间支持胚胎体外发育至关重要。本研究通过对胚胎培养液充气标准气,胚胎培养液以及胚胎培养密度的筛选,以建立一种可支持早期胚胎体外发育的密闭培养体系,并应用于空间环境条件对胚胎发育影响的研究。1.本研究选择了两种O2比例不同的标准气（5% O2,5% CO2,90% N2和10% O2,5% CO2,85% N2）、两种营养条件和缓冲体系不同的胚胎培养液（添加10%胎牛血清的mDPBS和CZB液）,并在培养液体积为200μL的前提下,选用三种培养密度（胚胎数/n∶培养液体积/μL为1:1, 1:2和1:4）,进行小鼠4细胞胚胎的密闭培养,同时设置不充气培养组和常规微滴培养对照组。通过观察和分析各组胚胎在密闭培养84 h时的囊胚发育率和胚胎孵化率,判定各培养组的胚胎培养效果。结果表明,利用5% O2比例的标准气进行胚胎培养液充气时,mDPBS和CZB液表现出类似的胚胎培养结果。1:1培养组的囊胚发育率与对照组无显著差异（P>0.05）,但胚胎孵化率显著低于相同培养密度的对照组（P<0.05）;1:2培养组的囊胚发育率与胚胎孵化率与相同培养密度的对照组无显著差异（P>0.05）;1:4培养组无论是囊胚发育率还是胚胎孵化率皆显著低于相同培养密度的对照组（P<0.05）。利用10% O2比例的标准气进行胚胎培养液充气时,mDPBS和CZB液表现出类似的胚胎培养结果。1:1培养组的囊胚发育率和胚胎孵化率与相同培养密度的对照组无显著差异（P>0.05）;1:2培养组和1:4培养组的囊胚发育率和胚胎孵化率皆显著低于相同培养密度的对照组（P<0.05）。培养液不充气密闭培养时,1:1培养组,1:2培养组和1:4培养组的囊胚发育率与胚胎孵化率皆显著低于相同培养密度的对照组。证明,在密闭培养体系中,胚胎培养密度过低会导致胚胎发育率和胚胎孵化率下降;培养液不充气密闭培养不能支持小鼠4细胞胚胎体外发育。2.在上述研究结果的基础上,在5% O2比例的标准气进行胚胎培养液充气时,利用mDPBS和CZB对小鼠4细胞胚胎进行密闭培养,以筛选小鼠胚胎密闭培养的适宜培养液。结果表明,相同培养密度下在mDPBS培养液中发育的胚胎,囊胚总细胞数显著低于在CZB培养液中发育的胚胎（P<0.05）,mDPBS组囊胚细胞的凋亡率显著高于CZB组（P<0.05）,而且在mDPBS中发育的胚胎形态学质量较差。证明CZB培养液支持密闭培养小鼠胚胎发育的能力优于mDPBS培养液。3.在上述研究结果的基础上,以CZB培养液为胚胎培养液,分别利用5% O2比例和10% O2比例的标准气进行胚胎培养液充气,比较不同培养密度下囊胚细胞总数以及囊胚细胞凋亡率的差异,并检测胚胎发育早期过氧化物产生情况和密闭培养过程中胚胎缺氧诱导因子1 alpha（HIF-1α）蛋白质表达情况。结果显示,利用5% O2比例的标准气进行胚胎培养液充气时,1:1培养组的囊胚细胞总数显著低于相同密度的对照组胚胎（P<0.05）,凋亡率显著高于对照组（P<0.05）;1:2培养组的囊胚细胞总数以及胚胎细胞凋亡率皆与相同密度对照组胚胎无显著差异（P>0.05）。利用10% O2比例的标准气进行胚胎培养液充气时,1:1培养组的囊胚细胞总数以及胚胎细胞凋亡率皆与相同密度对照组胚胎无显著差异（P>0.05）;1:2培养组的囊胚细胞总数皆显著低于相同密度的对照组胚胎（P<0.05）,凋亡率显著高于对照组（P<0.05）。在胚胎发育早期过氧化物产生情况检测时发现,利用10% O2比例的标准气进行胚胎培养液充气,密闭培养12 h时1:1培养组和1:2培养组胚胎过氧化物产生量高于对照组,而在利用5% O2比例的标准气进行胚胎培养液充气的密闭培养组中未见此现象。提示当标准气中O2比例为10%时,密闭培养的胚胎在发育早期可能出现氧化损伤。利用5% O2比例的标准气进行胚胎培养液充气时,1:1培养组在密闭培养60 h时胚胎中可检出HIF-1α表达;1:2培养组在密闭培养84 h时胚胎中可检出HIF-1α表达。利用10% O2比例的标准气进行胚胎培养液充气时,1:1培养组在密闭培养84 h时胚胎中可检出HIF-1α表达;1:2培养组在密闭培养84 h时胚胎中未检出HIF-1α表达。综上所述,小鼠胚胎密闭培养的适宜培养液为CZB液,将胚胎密度为1:2的小鼠4细胞胚胎密闭培养于经5% O2标准气充气处理的培养液中,胚胎可较好地发育至囊胚和孵化胚阶段。

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摘要

ABSTRACT

文献综述

第一章小鼠胚胎体外培养研究进展

1.1 培养环境对小鼠胚胎体外发育的影响

1.1.1 胚胎培养液的组成要素及其对胚胎体外发育的作用

1.1.2 温度条件对胚胎发育的影响

1.1.3 气相条件对胚胎发育的影响

1.1.4 湿度条件对胚胎发育的影响

1.1.5 pH 对早期胚胎发育的影响

1.1.6 胚胎培养密度对胚胎发育的影响

1.2 早期胚胎体外培养的常用方法及特点

1.3 胚胎质量与胚胎发育能力的评价

第二章密闭培养体系中的小鼠胚胎发育特点

2.1 微重力及模拟微重力条件对动物胚胎发育的影响

2.2 密闭培养的必要性和密闭培养体系的特点

2.2.1 密闭培养的必要性

2.2.2 空间培养对胚胎发育阶段的限制要求

2.3 动物细胞应对低氧环境的方法

2.3.1 缺氧诱导因子家族

2.3.2 HIF-1 氧调节机制

2.3.3 HIF-1 降低组织缺氧损伤的调控途径

2.3.4 HIF-1 与细胞凋亡的关系

2.4 活性氧分子对细胞生长与胚胎发育的影响

2.4.1 ROS 引起DNA 损伤

2.4.2 ROS 引起脂膜损伤

2.4.3 ROS 引起蛋白质损伤

2.4.4 ROS 引起细胞凋亡

2.5 胚胎密闭培养体系需要解决的主要问题

试验研究

第三章小鼠早期胚胎密闭培养研究

3.1 材料与方法

3.1.1 试验材料

3.1.2 试验方法

3.2 结果与分析

2 比例为5%时密闭培养小鼠4 细胞胚胎体外发育结果'>3.2.1 标准气O₂ 比例为5%时密闭培养小鼠4 细胞胚胎体外发育结果

2 比例为10%时密闭培养小鼠4 细胞胚胎体外发育结果'>3.2.2 标准气O₂ 比例为10%时密闭培养小鼠4 细胞胚胎体外发育结果

3.2.3 小鼠4 细胞胚胎不充气密闭培养胚胎体外发育结果

3.2.4 小鼠4 细胞胚胎微滴法培养胚胎体外发育结果

3.3 讨论

3.3.1 密闭培养体系对胚胎培养环境的要求

3.3.2 小鼠4 细胞胚胎在不同培养体系中的发育规律

3.4 小结

第四章小鼠胚胎密闭培养的培养液筛选

4.1 材料与方法

4.1.1 试验材料

4.1.2 试验方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论

4.4 小结

第五章小鼠早期胚胎密闭培养的培养液充气标准气筛选

5.1 材料与方法

5.1.1 试验材料

5.1.2 试验方法

5.2 结果与分析

5.2.1 囊胚细胞计数与胚胎细胞凋亡统计结果

5.2.2 胚胎内过氧化物产生情况检测结果

5.2.3 缺氧诱导因子HIF-1α蛋白质表达检测结果

5.3 讨论

2 比例的充气标准气对密闭培养早期胚胎发育的影响'>5.3.1 5% O₂比例的充气标准气对密闭培养早期胚胎发育的影响

2 比例的标准气对密闭培养早期胚胎发育的影响'>5.3.2 10% O₂比例的标准气对密闭培养早期胚胎发育的影响

5.4 小结

结论

参考文献

致谢

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