CTGF ASODN抗兔青光眼术后滤过泡疤痕形成的实验研究

论文摘要

目的本实验以青光眼滤术过后兔为模型,通过脂质体介导结缔组织生长因子反义核苷酸（ connective tissue growth factor antisense oligonucleotide, CTGF ASODN）干扰体外培养兔眼结膜成纤维细胞增生,观察结缔组织生长因子反义寡核苷酸对滤过手术后滤过泡瘢痕形成的影响;研究结缔组织生长因子在抗青光眼手术后滤过泡疤痕形成中的作用;为抗滤过泡区瘢痕提出了新的解决思路。方法取兔眼小梁切除术后第5d之手术区结膜及板层巩膜行成纤维细胞原代培养。利用脂质体介导,将经异硫氰酸荧光素（ fluorescein isothiocyanate, FITC）标记的结缔组织生长因子反义核苷酸转染至兔抗青光眼滤过手术（glaucoma filtering surgery, GFS）后滤过泡疤痕组织成纤维细胞中,利用半定量逆转录-聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）和检验结缔组织生长因子mRNA的表达,用蛋白免疫印迹法（Western-Blot法）检验蛋白合成量。以相对灰度值为指标,观察CTGF ASODN对CTGF表达的抑制效果。结果（1）转染结缔组织生长因子反义寡核苷酸6h后可见研究组（A组）细胞胞浆中黄绿色荧光。12h后,研究组细胞胞浆内可见大量荧光,对照组仅见少量荧光或无此现象;（2）研究组CTGF在mRNA水平的相对灰度值（mRNA index,RI）明显低于对照组,RI值为0.457±0.035（P<0.01 vs D group）。相应的蛋白水平表达也呈相同趋势,比值为0.177±0.022（P<0.01 vs D group）。结论（1）脂质体能有效介导结缔组织生长因子反义寡核苷酸（2）结缔组织生长因子反义寡核苷酸能在脂质体介导下较有效的抑制体外培养成纤维细胞的CTGF mRNA的表达以及CTGF蛋白的合成。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 1.1 概述
• 1.2 关于结缔组织生长因子
• 1.3 关于反义寡核苷酸技术
• 第2章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要药品及试剂
• 2.1.2 主要实验仪器及设备
• 2.1.3 试剂配制
• 2.1.4 实验动物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 实验分组
• 2.2.2 手术方法
• 2.2.3 组织取材
• 2.2.4 细胞培养
• 2.2.5 CTGF m RNA 引物及反义核苷酸设计
• 2.2.6 基因转染
• 2.2.7 荧光标记OND 脂质体转染观察
• 2.2.8 细胞爬片的制作
• 2.2.9 RT－PCR检测
• 2.2.10 Western Blot
• 2.3 统计学分析
• 第3章 结 果
• 3.1 成纤维细胞的原代培养
• 3.2 FITC 荧光标记CTGF 反义核苷酸在细胞中的分布
• 3.3 RT－PCR 法检测CTGF 表达的结果
• 3.4 Western-Blot法检测CTGF的蛋白水平表达
• 第4章 讨论
• 4.1 概述
• 4.2 关于CTGF
• 4.3 关于CTGF反义寡核苷酸
• 4.4 关于本实验结果
• 4.4.1 原代培养
• 4.4.2 实验分组
• 4.4.3 脂质体的应用
• 4.4.4 CTGF ASODN 对 CTGF 表达的影响
• 4.4.5 实验中存在的问题
• 第5章 结论及展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附图
• 综述
• 攻读学位期间的研究成果