脂质体介导抑制素基因转染对牛卵泡细胞及胚胎发育的影响及机制研究

论文摘要

本研究应用细胞培养、质粒提取、脂质体转染、RT-PCR（反转录PCR）、TUNEL（脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法）、RIA（放射免疫测定）和流式细胞分类等技术,利用本实验室构建的卵泡抑制素α亚基片段基因重组质粒即pEGISI,转染不同大小的牛卵泡颗粒细胞及卵母细胞,研究pEGISI在颗粒细胞、卵母细胞中的表达以及对颗粒细胞激素分泌、细胞增殖和细胞凋亡以及对卵母细胞成熟、体外受精和胚胎发育的影响,以探讨卵泡抑制素对卵泡发育的局部调节作用及作用机制。主要内容如下:1.pEGISI转染对卵泡颗粒细胞增殖、凋亡、激素分泌及共培养的卵母细胞和胚胎发育的影响为了了解抑制素基因转染卵泡的颗粒细胞后基因表达对颗粒细胞增殖、凋亡和激素分泌,以及转染的颗粒细胞同卵母细胞共培养对卵母细胞成熟、体外受精和胚胎发育的影响。本试验利用pEGISI质粒转染来源于牛中腔（直径,＞4mm-8mm）、小腔（直径,1mm-4mm）颗粒细胞,转染后48 h、96 h分别检测颗粒细胞的增殖、凋亡及雌激素和孕酮的分泌量,并检测共培养后的卵母细胞的发育情况。结果显示,脂质体介导的pEGISI转染颗粒细胞后,来自中腔卵泡的颗粒细胞增殖率（88.8±2.1%;平均值±标准差）显著低于对照组（100%）和转染pEGFP组（97.5±2.1%）,对小腔卵泡颗粒细胞的增殖在各组之间无显著差异。pEGISI转染颗粒细胞后显著加剧了颗粒细胞的凋亡。转染颗粒细胞48 h后雌激素分泌量均增加,而孕酮分泌量下降。转染后的中腔卵泡颗粒细胞与卵母细胞共培养,降低了卵母细胞的成熟率（61.5±6.8%vs.71.2±5.7%,P＜0.05）,但对体外受精和胚胎发育没有影响。这些结果表明,pEGISI在颗粒细胞中的超表达对颗粒细胞的增殖、凋亡和卵母细胞成熟有着重要的调节作用,其作用因颗粒细胞发育时期不同而异。2.pEGISI转染卵母细胞对其成熟及胚胎发育的影响为了了解抑制素基因对卵母细胞成熟及胚胎发育的影响,本试验利用pEGISI质粒直接转染卵母细胞,然后检测抑制素基因在卵母细胞中的表达,以及转染的卵母细胞成熟率和体外受精后胚胎发育情况,结果显示:（1）脂质体介导的抑制素片段转染能够成功地通过透明带进入卵母细胞,并且能够高效表达。（2）转染本身对卵母细胞成熟及体外受精能力没有伤害。（3）高效表达的抑制素片段对卵母细胞的成熟,体外受精以及胚胎发育没有影响。3.pEGISI转染卵母细胞复合体对其成熟及胚胎发育的影响为了进一步了解抑制素基因对卵母细胞复合体成熟及胚胎发育的影响。本试验用pEGISI质粒转染牛卵母细胞复合体,检测pEGISI在卵母细胞复合体中的超表达、卵丘细胞扩散、凋亡和激素分泌、以及卵母细胞复合体成熟、体外受精和胚胎发育的情况。结果显示:质粒pEGISI转染牛卵丘卵母细胞复合体,对中、小卵泡的卵丘细胞扩散有抑制作用,对中腔卵泡卵丘细胞的抑制作用尤为显著（69.8±2.7%,p＜0.05）。质粒pEGISI转染加剧了中、小卵泡卵丘细胞的凋亡,对中腔卵泡卵丘细胞的凋亡作用尤为显著（14.5±0.5%,p＜0.01）。此外,质粒pEGISI转染牛卵丘卵母细胞复合体后,促进了雌激素的分泌。转染后的牛中腔卵泡卵母细胞复合体成熟培养后,卵母细胞的成熟率降低（57.9±8.4%,p＜0.05）,但对体外受精率和胚胎发育没有不良影响。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第一部分 文献综述 卵泡抑制素对牛卵泡发育和体外受精及胚胎发育的作用研究进展
• 1 激素作用方法学研究进展
• 1.1 提供外源激素
• 1.1.1 注射激素
• 1.1.2 激素基因治疗
• 1.1.3 器官移植
• 1.1.4 刺激合成
• 1.2 去除内源激素法
• 1.2.1 摘除分泌器官
• 1.2.2 基因敲除
• 1.2.3 基因免疫
• 1.2.4 激素免疫
• 1.2.5 RNAi
• 1.2.6 阻断受体
• 1.2.7 抑制合成
• 1.3 用基因治疗法研究卵泡发育的意义
• 2 卵泡抑制素对牛卵泡发育的作用研究进展
• 2.1 卵泡抑制素对牛卵泡发育的局部调节作用
• 2.1.1 抑制素的结构和特性
• 2.1.2 抑制素亚单位在卵巢内的表达及作用
• 2.2 卵泡抑制素对FSH分泌的作用
• 2.3 卵泡抑制素与其他激素的相互关系
• 2.3.1 卵泡抑制素与激活素的关系
• 2.3.2 卵泡抑制素与类固醇激素的关系
• 2.3.3 卵泡抑制素与卵泡抑素的关系
• 2.3.4 卵泡抑制素对LH分泌的影响
• 3 卵泡抑制素对牛卵母细胞体外成熟的调控研究进展
• 3.1 卵母细胞成熟的调节机理
• 3.2 卵泡抑制素对牛卵母细胞体外成熟的调控
• 4 卵泡抑制素对牛卵母细胞体外受精及胚胎发育的作用研究进展
• 4.1 体内研究
• 4.2 体外研究
• 第二部分 试验研究
• 1 卵泡抑制素基因转染对卵泡颗粒细胞增殖、凋亡、激素分泌及共培养的卵母细胞和胚胎发育的影响
• 1.1 前言
• 1.2 材料和方法
• 1.2.1 材料
• 1.2.2 方法
• 1.2.2.1 质粒的鉴定与制备
• 1.2.2.2 牛卵泡GCs的分离和培养
• 1.2.2.3 抑制素基因重组质粒pEGISI转染GCs步骤
• 1.2.2.4 细胞增殖的检测
• 1.2.2.5 Annexin V/FITC染色法检测细胞凋亡
• 1.2.2.6 培养液的采集和激素测定
• 1.2.2.7 牛卵母细胞获取和成熟培养
• 1.2.2.8 卵母细胞的成熟鉴定
• 1.2.2.9 体外受精
• 1.2.2.10 体外胚胎培养
• 1.2.3 统计分析
• 1.3 试验结果
• 1.3.1 pEGISI质粒提取后的酶切鉴定
• 1.3.2 脂质体介导的pEGISI基因转染GCs的鉴定及表达情况
• 1.3.3 RT-PCR方法检测pEGISI在GCs内转录情况
• 1.3.4 转染条件的优化
• 1.3.5 pEGISI转染GCs对其增殖的影响
• 1.3.6 pEGISI转染GCs对其凋亡的影响
• 1.3.7 pEGISI转染GCs对其激素分泌的影响
• 1.3.8 pEGISI转染GCs与卵母细胞共培养对卵母细胞成熟的影响
• 1.3.9 pEGISI转染GCs对胚胎发育的影响
• 1.4 讨论
• 1.5 小结
• 2 卵泡抑制素基因转染卵母细胞对其成熟及胚胎发育的影响
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 方法
• 2.2.2.1 卵母细胞的获取
• 2.2.2.2 质粒转染卵母细胞的步骤
• 2.2.2.3 转染后卵母细胞DNA提取
• 2.2.2.4 转染条件的优化
• 2.2.2.5 转染率的计算
• 2.2.2.6 卵母细胞的成熟鉴定体外受精体外胚胎培养
• 2.2.3 统计分析
• 2.3 试验结果
• 2.3.1 pEGISI质粒转染卵母细胞可能性
• 2.3.1.1 PCR扩增卵母细胞总DNA检测转染的可能性
• 2.3.1.2 pEGISI转染卵母细胞后在卵母细胞中表达
• 2.3.2 pEGISI质粒转染卵母细胞条件的优化
• 2.3.3 pEGISI质粒转染卵母细胞后对卵母细胞成熟及胚胎发育的影响
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 3 卵泡抑制素基因转染卵丘卵母细胞复合体对其成熟及胚胎发育的影响
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 方法
• 3.2.2.1 卵母细胞的筛选与分级
• 3.2.2.2 质粒转染卵母细胞
• 3.2.2.3 体外成熟培养
• 3.2.2.4 卵母细胞扩散程度分析
• 3.2.2.5 卵母细胞成熟分析
• 3.2.2.6 TUNEL法检测卵母细胞COC凋亡
• 3.2.2.7 培养液的采集和激素测定
• 3.2.3 统计分析
• 3.3 试验结果
• 3.3.1 pEGISI转染COCs后的表达情况
• 3.3.2 pEGISI转染对COCs扩散的影响
• 3.3.3 pEGISI转染对COCs凋亡的影响
• 3.3.4 pEGISI转染对COCs成熟的影响
• 3.3.5 pEGISI转染对COC激素分泌的影响
• 3.3.5.1 pEGISI转染对COCs雌激素分泌的影响
• 3.3.5.2 pEGISI转染对COCs孕激素分泌的影响
• 3.3.6 pEGISI转染对COCs体外受精和胚胎发育的影响
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 总结与创新点
• 1 总结
• 2 创新点
• 参考文献
• 附录
• 附录1:主要仪器和设备
• 附录2:主要试剂
• 附录3:主要培养液及操作液配方
• 附录4 攻读学位期间已发表或待发表学术论文
• 致谢