嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌复合发酵合成共轭亚油酸的研究

论文摘要

共轭亚油酸（CLA）是含有共轭双键的一系列十八碳二烯酸位置和几何异构体的总称,是具有多种生理活性的天然脂肪酸,如抗癌、抗粥样动脉硬化、减肥、抗氧化、预防糖尿病、免疫调节等生理活性。目前,CLA工业化生产主要由化学异构法制得,但其产物异构体组成较为复杂。而利用微生物合成CLA,异构体组成单一、反应条件温和,并且主要产物是具有生理功能的c9,t11-CLA;和t10,c12-CLA异构体,因此生物合成CLA已受到越来越多的重视。本文从淘米水中筛选出一株高产CLA的菌株,通过菌株的形态特征及生理生化实验,确定其为植物乳杆菌Y8（Lactobacillus plantarum）。以该植物乳杆菌和实验室保藏的嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）为出发菌株,优化其混菌复合发酵的培养条件。采用紫外分光光度法对CLA进行定量分析。通过紫外诱变、硫酸二乙酯诱变选育出两株将LA转化为CLA能力较高的菌株,采用响应曲面法优化混菌复合发酵条件,进一步提高CLA产量。植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌原始菌株在不同培养基中混菌复合发酵产CLA的最佳条件为：在脱脂乳培养基（SKM）中,培养温度34℃,培养时间72h,接种量5.0%,培养基初始pH5.5,底物添加量4%,菌种比例4：1（Y8：La）时CLA合成量达到160.35μg/mL；在MRS培养基中,培养温度34℃,培养时间48h,接种量3.0%,培养基初始pH6.5,底物添加量3.5%,菌种比例4：1（Y8：La）时CLA合成量为μg/mL;将植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行紫外诱变和硫酸二乙酯诱变,选取高CLA产量的突变株Y8-1和La-1,其中Y8-1的CLA产量为83.52μg/mL,较原始菌株提高了45.61%；La-1的CLA产量为65.37μg/mL,较原始菌株提高了83.16%。响应曲面法优化Y8-1和La-1混菌复合发酵,产CLA的发酵条件为：培养温度36.5。C,底物添加量5.0%,pH6.5,接种量为5.0%,菌种比例（Y8-1：La-1）4：1,培养时间48h,CLA的最高产量为319.26μg/mL,比原始菌株的CLA产量提高了99.1%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 共轭亚油酸的结构和特点
• 1.2 共轭亚油酸的生理功能
• 1.2.1 抗癌作用
• 1.2.2 抗动脉粥样硬化
• 1.2.3 降脂作用
• 1.2.4 预防糖尿病
• 1.2.5 免疫调节作用
• 1.2.6 对骨质代谢和身体组成的影响
• 1.2.7 营养再分配作用
• 1.2.8 促进生长发育
• 1.2.9 其他功能
• 1.3 共轭亚油酸的发现及其安全性
• 1.4 共轭亚油酸的主要来源
• 1.4.1 天然来源
• 1.4.1.1 瘤胃中CLA的生产
• 1.4.1.2 内源合成
• 1.4.2 人工合成
• 1.4.2.1 化学异构法
• 1.4.2.2 生物异构法
• 1.5 CLA检测方法
• 1.5.1 紫外检测法
• 1.5.2 红外检测法
• 1.5.3 气相色谱法
• 1.5.4 高效液相色谱法
• 1.5.5 气-质联用
• 1.5.6 核磁光谱法
• 1.6 混菌发酵法
• 1.6.1 联合发酵
• 1.6.2 顺序发酵
• 1.6.3 共固定化细胞混菌发酵
• 1.6.4 混合固定化细胞混菌发酵
• 1.7 微生物诱变育种
• 1.7.1 诱变方法
• 1.7.2 诱变机理
• 1.7.3 产CLA乳酸菌的诱变
• 1.8 本论文的主要研究意义及内容
• 1.8.1 研究意义
• 1.8.2 研究内容
• 第二章 菌株的分离鉴定及原始菌株混菌复合发酵条件优化
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 试验试剂
• 2.1.2 主要实验仪器
• 2.2 菌种
• 2.3 培养基
• 2.4 试验方法
• 2.4.1 亚油酸及其乳化液的制备
• 2.4.2 CLA紫外光谱定量分析检测方法的确立
• 2.4.3 滴定酸度的测定
• 2.4.4 菌数的测定
• 2.4.5 菌株的活化
• 2.4.6 产共轭亚油酸菌株的分离
• 2.4.6.1 淘米水稀释倾注分离
• 2.4.6.2 菌株的筛选
• 2.4.7 产共轭亚油酸菌株的初步鉴定
• 2.4.7.1 革兰氏染色及形态显微观察
• 2.4.7.2 产CLA乳酸菌属的鉴定
• 2.4.7.3 产CLA乳酸菌种的鉴定
• 2.4.8 原始菌株不同培养方式结果比较
• 2.4.9 原始菌株在不同培养基中混菌发酵条件的优化
• 2.4.9.1 菌体生长曲线的绘制
• 2.4.9.2 底物添加量对共轭亚油酸生物合成的影响
• 2.4.9.3 菌种比例对共轭亚油酸生物合成的影响
• 2.4.9.4 培养基初始PH对共轭亚油酸生物合成的影响
• 2.4.9.5 培养时间对共轭亚油酸生物合成的影响
• 2.4.9.6 接种量对共轭亚油酸生物合成的影响
• 2.4.9.7 培养温度对共轭亚油酸生物合成的影响
• 2.4.9.8 正交试验
• 2.5 结果与讨论
• 2.5.1 CLA标准品紫外光谱曲线的测定
• 2.5.1.1 CLA的紫外波长扫描
• 2.5.1.2 CLA标准曲线的制作
• 2.5.2 菌株的分离与筛选
• 2.5.3 筛选菌株的初步鉴定与生理生化实验鉴定
• 2.5.3.1 筛选菌株的初步鉴定
• 2.5.3.2 筛选菌株的生理生化鉴定
• 2.5.4 原始菌株不同培养方式结果比较
• 2.5.5 原始菌株在不同培养基中混菌发酵条件优化
• 2.5.5.1 菌株生长曲线的绘制
• 2.5.5.2 底物添加量对共轭亚油酸生物合成的影响
• 2.5.5.3 菌种比例对共轭亚油酸生物合成的影响
• 2.5.5.4 培养基初始PH对共轭亚油酸生物合成的影响
• 2.5.5.5 培养时间对共轭亚油酸生物合成的影响
• 2.5.5.6 接种量对共轭亚油酸生物合成的影响
• 2.5.5.7 培养温度对共轭亚油酸生物合成的影响
• 2.5.5.8 正交试验
• 2.5.5.9 原始菌株在不同培养基中混菌发酵的CLA产量结果比较
• 2.6 本章小结
• 第三章 原始菌株的诱变及诱变菌株混菌复合发酵条件优化
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 试验试剂
• 3.1.2 主要实验仪器
• 3.2 菌种
• 3.3 培养基
• 3.4 试验方法
• 3.4.1 高产CLA菌株的诱变选育
• 3.4.1.1 供试菌体的培养
• 3.4.1.2 紫外诱变
• 3.4.1.3 硫酸二乙酯诱变
• 3.4.1.4 诱变菌株的稳定性研究
• 3.4.2 CLA高产菌株混菌复合发酵条件的确定
• 3.4.2.1 菌体生长曲线的绘制
• 3.4.2.2 试验因素水平的确定
• 3.4.2.3 响应曲面法得出最佳发酵条件
• 3.5 结果与讨论
• 3.5.1 诱变条件的确定
• 3.5.1.1 紫外处理菌体致死率曲线
• 3.5.1.2 硫酸二乙醋处理菌体致死率曲线
• 3.5.2 诱变后的发酵实验
• 3.5.2.1 紫外诱变菌株的蹄选
• 3.5.2.2 硫酸二乙醋诱变菌株的蹄选
• 3.5.3 诱变菌株的稳定性研究
• 3.5.3.1 紫外诱变菌株稳定性旳研究
• 3.5.3.2 硫酸二乙酯诱变菌株稳定性的研究
• 3.5.4 CLA高产菌株复合发酵条件的确定
• 3.5.4.1 Y8-1和La-1生长曲线的绘制
• 3.5.4.2 培养基初始pH对菌体生长及共辆亚油酸生物合的影响
• 3.5.4.3 培养温度对菌体生长及共轭亚油酸生物合的影响
• 3.5.4.4 培养时间对菌体生长及共辆亚油酸生物合的影响
• 3.5.4.5 接种量对菌体生长及共辆亚油酸生物合的影响
• 3.5.4.6 底物添加量对菌体生长及共辆亚油酸生物合的影响
• 3.5.4.7 响应曲面法优化诱变菌株最佳混菌发酵条件
• 3.6 本章小结
• 第四章 结论与建议
• 4.1 结论
• 4.2 进一步研究建议
• 参考文献
• 致谢