HSV1 gB、HSV1 gD、HSV2 gD三种蛋白胞外区抗原性分析及克隆表达、纯化鉴定

论文摘要

单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus,HSV）是危害人类健康的常见病原体,其感染发病率高,且容易导致复发性感染和潜伏感染。HSV有1型（HSV1）及2型（HSV2）两型,HSV1主要引起口面部感染、眼部感染和疱疹性脑炎等;HSV2主要引起生殖器感染,并且和女性宫颈癌的发生密切相关。目前国内外无HSV疫苗,在积极研制。HSV包膜蛋白在病毒的吸附、入侵和刺激机体产生免疫应答及疫苗研制中具有重要地位,其中gB蛋白和gD蛋白能诱发特异性应答,具有重要的抗原表位,是宿主细胞免疫和体液免疫的主要靶标之一,因此gB、gD蛋白是构建HSV疫苗的理想抗原。本研究分析筛选HSV1 gD、HSV1 gB、HSV2 gD三种蛋白的抗原表位,利用基因工程技术表达三种蛋白,为研制重组HSV1型及2型二价疫苗奠定基石出。通过对HSV1 gB、gD及HSV2 gD三种蛋白的抗原表位分析,筛选三种蛋白含强抗原决定簇较集中的胞外区片段,选用真核和原核细胞均偏爱的密码子,并对设计基因的RNA结构进行优化,化学合成HSV1 gB、HSV1 gD、HSV2 gD含信号肽序列的基因序列。以化学合成的HSV1 gB、HSV1 gD、HSV2 gD含信号肽序列的胞外区基因序列为模板,用PCR方法扩增HSV1 gB、HSV1gD、HSV2gD胞外区1～696aa1l～284aa、1～284aa的基因片段,并将其插入原核表达载体pGEX-4T-2内,获得的重组质粒转化大肠杆菌TG1,IPTG诱导表达及SDS-PAGE鉴定分析。表达的HSV1gB/GST、HSV1 gD/GST、HSV2gD/GST融合蛋白分子量分别为96kd、56kd、56kd。利用亲和层析方法,纯化获得可溶性重组HSV1gB、HSV1gD、HSV2gD蛋白。将纯化获得的融合蛋白HSV1gB/GST倍比稀释,用Human HSV1ELISA试剂盒检测表达蛋白HSV1gB/GST的抗原性。将纯化获得的HSV1gD/GST、HSV2gD/GST融合蛋白倍比稀释,用HRP标记的HSV1+HSV2抗体检测表达蛋白HSV1gD/GST、HSV2gD/GST的抗原性。结果显示,表达的三种融合蛋白具有较好的抗原性和特异性。将纯化后的重组表达蛋白HSV1gD/GST用凝血酶切去GST标签后作为抗原免疫新西兰白兔,取兔耳缘静脉血用间接ELISA法检测抗HSVgD1抗体效价≥1:64 000。表明重组表达蛋白HSVgD1有良好的免疫反应性。以化学合成的HSV1gB、HSV1gD、HSV2gD含信号肽序列的胞外区基因序列为模板,PCR扩增HSV1gB、HSV1gD、HSV2gD胞外区含信号肽序列1～706aa、1-314aa、1-314aa的基因片段,将其插入真核表达载体pcDNA3.1（+）内,用脂质体转染法转染HEK 293细胞,Western Blot分析检测目的蛋白在胞内和胞外的表达。结果显示,表达的HSV1gD、HSV2gD蛋白在胞内及培养上清内均存在,而HSV1gB蛋白未表达。合成HSV1gB蛋白基因不表达提示,在真核表达系统中,基因的RNA二级结构比密码子使用频率更重要。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 技术路线
• 第一部分 HSVgB1、HSvgD1、HSVgD2三种蛋白抗原表位分析及基因设计合成
• 材料与方法
• 结果
• 分析与讨论
• 第二部分 HSVgB1、HSVgD1、HSVgD2三种蛋白胞外区基因片段的克隆、表达及产物纯化
• 材料与方法
• 结果
• 分析与讨论
• 第三部分 HSVgB1、HSVgD1、HSVgD2蛋白的抗原性分析及免疫抗血清的制备
• 材料与方法
• 结果
• 分析与讨论
• 第四部分:HSVgB1、HSvgD1、HSVgD2三种糖蛋白真核表达载体的构建及表达分析
• 材料与方法
• 结果
• 分析与讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 综述
• 参考文献