禾谷镰刀菌AMT1基因的功能研究

论文摘要

禾谷镰刀菌是小麦赤霉病的优势种之一,它不但可以危害小麦还可以侵染其它小粒谷物和玉米等植物。小麦赤霉病不但会导致作物产量和品质的下降,其产生的真菌毒素还会危害人畜的健康。在过去十几年中小麦赤霉病在世界范围内大面积爆发,造成小麦严重的产量损失和真菌毒素污染。但这也推动了禾谷镰刀菌研究的迅速发展,使其成为在致病性、种群遗传、进化和基因组学方面研究的比较深入的植物病原真菌之一。随着化学杀菌剂的大规模使用一些地方已经出现了抗药菌株,这大大增加了小麦赤霉病再次爆发的风险。鉴于小麦赤霉病巨大的破坏性、抗性品种育种困难、抗性资源少等原因,对于禾谷镰刀菌致病机制的研究已经迫在眉睫。本实验基于反向遗传学的策略,通过基因敲除技术得到amt1缺失突变体,再通过对该突变体表型变化的观察来推断该基因的功能。本实验采用split PCR的方法来构建含有hph（潮霉素磷酸转移酶基因）的基因敲除盒,再通过PEG介导的原生质体转化和体内同源重组得到抗潮霉素的转化子。用四对引物对得到的转化子进行PCR检测,然后再进行southern验证,从而得到真正的amt1缺失突变体。我们对该突变体进行菌落生长速度测量和形态观察以及产孢率、有性杂交、萌发实验、小麦和玉米侵染试验等来观察其表型和致病力的变化。发现AMT1基因的缺失可以使菌落生长速度稍稍减慢、气生菌丝稀疏、萌发减慢,但是并不影响分生孢子和子囊孢子的产生。另外amt1缺失突变体对小麦和玉米的致病性有所降低,并且在小麦接种点籽粒产生真菌毒素（DON）的含量降低到正常水平的48.6%。本实验还通过实时荧光定量PCR的方法检测到几种可能和致病相关基因在amt1缺失突变体中的转录水平下降到野生型的14%-44%,这几种基因转录水平的下降以及真菌毒素DON的降低可能都是导致致病力下降的主要原因。本实验还通过构建互补载体将野生型PH-1中的AMT1基因插入到amt1缺失突变体的基因组上,结果发现amt1缺失突变体的表型缺陷都回复到了野生型的水平。从而证明了amt1缺失突变体的所有表型缺陷都是由于AMT1基因的缺失引起的。另外我们还构建了AMT1-GFP融合载体来转化amt1缺失突变体,在荧光显微镜下观察到Amt1p在细胞核和细胞质中都有表达但主要集中在核里,这与其精氨酸转移酶的功能是相符的。基于该基因在酵母中的同源基因HMT1可以影响核不均一核糖核蛋白（hnRNPs）的核外转运,我们构建了fgHRP1-GFP和fgNAB2-GFP载体来转化野生型和amt1缺失突变体。结果发现AMT1的缺失影响到fgHrp1p的亚细胞定位,但对fgNab2p表达和定位却没有影响。本研究对禾谷镰刀菌中AMT1基因的功能进行了初步的探索,如果想要进一步弄清楚AMT1的基因的功能仍需要进行蛋白理化性质、蛋白互作等方面的研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 禾谷镰刀菌生物学特征
• 1.2 禾谷镰刀菌危害
• 1.3 禾谷镰刀菌研究进展
• 1.4 AMT1 基因研究背景
• 1.5 本研究的目的和意义
• 第二章 AMT1 基因敲除盒的构建
• 2.1 材料、试剂和仪器
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 PH-1 基因组DNA 的提取——CTAB 法
• 2.2.2 质粒pC81003 的制备
• 2.2.3 禾谷镰刀菌AMT1 基因序列的获得与引物设计
• 2.2.4 Split PCR 方法构建AMT1 基因敲除盒
• 2.2.5 PCR 产物浓缩
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 AMT1 基因及蛋白序列分析
• 2.3.2 AMT1 基因敲除盒的构建
• 2.4 讨论
• 第三章 AMT1 基因敲除和转化子的鉴定
• 3.1 材料、试剂和仪器
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 仪器
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 野生型禾谷镰刀菌原生质体的制备和转化
• 3.2.2 amt1 敲除突变体的筛选和鉴定
• 3.3 结果
• 3.3.1 PCR 检测得到4 个阳性转化子
• 3.3.2 southern blot 验证得到2 个amt1 缺失突变体
• 3.4 讨论
• 第四章 amt1 敲除突变体的表型观察和致病力检测
• 4.1 材料、试剂和仪器
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 试剂
• 4.1.3 仪器
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 菌落形态观察及生长速度测定
• 4.2.2 产孢率测定
• 4.2.3 萌发实验
• 4.2.4 有性杂交
• 4.2.5 过氧化氢压力筛选试验
• 4.2.6 小麦穗接种试验
• 4.2.7 玉米须接种试验
• 4.2.8 玉米杆接种试验
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 amt1 缺失突变体表型变化
• 4.3.2 基因AMT1 的缺失不影响无性生殖和有性生殖
• 4.3.3 amt1 缺失突变体生长受过氧化氢抑制
• 4.3.4 amt1 缺失突变体对小麦和玉米的致病力下降
• 4.4 讨论
• 第五章 AMT1 基因功能回复验证
• 5.1 材料、试剂和仪器
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 试剂
• 5.1.3 仪器
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 互补引物的设计
• 5.2.2 目的基因片段的扩增
• 5.2.3 载体pHZ100 和PCR 产物的双酶切和连接
• 5.2.4 连接产物的转化及互补载体的鉴定
• 5.2.5 互补载体转化PH-1 及互补转化子的筛选
• 5.2.6 互补转化子功能回复鉴定
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 互补载体的构建
• 5.3.2 互补转化子的获得
• 5.3.3 AMT1 基因使amt1 缺失突变体表型和致病力恢复
• 5.4 讨论
• 第六章 AMT1 基因编码蛋白的表达和亚细胞定位
• 6.1 材料、试剂和仪器
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 试剂
• 6.1.3 仪器
• 6.2 试验方法
• 6.2.1 亚细胞定位引物设计
• 6.2.2 亚细胞定位载体的构建
• 6.2.3 亚细胞定位载体的转化及转化子的筛选
• 6.2.4 荧光显微镜下观察Amt1-GFP 表达和亚细胞定位
• 6.2.5 AMT1 基因转录水平分析
• 6.3 结果
• 6.3.1 亚细胞定位载体的构建
• 6.3.2 亚细胞定位转化子的获得以及Amt1p 的表达和亚细胞定位
• 6.4 讨论
• 第七章 AMT1 基因的缺失对fgHrp1p 和fgNa62p 转运的影响
• 7.1 材料、试剂和仪器
• 7.1.1 材料
• 7.1.2 试剂
• 7.1.3 仪器
• 7.2 试验方法
• 7.3 结果
• 7.3.1 fgHRP1-GFP 和fgNA82-GFP 融合载体的构建、转化以及转化子的筛选
• 7.3.2 fgHrp1-GFP 和fgNa62-GFP 融合蛋白的表达和亚细胞定位
• 7.4 讨论
• 第八章 amt1 缺失突变体中致病相关因子转录水平的检测
• 8.1 材料、试剂和仪器
• 8.1.1 材料
• 8.1.2 试剂
• 8.1.3 仪器
• 8.2 试验方法
• 8.2.1 RNA 提取前的准备
• 8.2.2 RNA 提取
• 8.2.3 RNA 纯化
• 8.2.4 cDNA 的制备
• 8.2.5 实时荧光定量PCR
• 8.3 结果与分析
• 8.4 讨论
• 第九章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介