论文摘要
目的:研究种去泛素化酶──泛素C末端水解酶L1（UCH-L1）对大鼠血管平滑肌细胞（VSMC）迁移的生物学作用,探索UCH-L1通过影响核转录因子（NF-κB）活性调控VSMC迁移的分子机制,为深刻认识动脉粥样硬化等血管疾病的病理生理学机理提供新的科学依据。方法:采用组织块贴壁法体外培养健康雄性Wistar大鼠的胸主动脉血管平滑肌细胞,用-平滑肌肌动蛋白（ -actin）抗体对细胞进行免疫荧光鉴定;以肿瘤坏死因子-（TNF- ）诱导VSMC的迁移,采用改良的Boyden小室方法和划痕法（Wound Scratch Assay）检测细胞迁移能力。观察不同浓度的TNF-对VSMC迁移的诱导效应及不同作用时间下细胞迁移变化,探索TNF-诱导VSMC迁移效率较高时最佳的细胞培养密度和作用时间;用Westen Blot法检测UCH-L1在TNF-诱导VSMC迁移过程中蛋白表达水平的变化,研究UCH-L1表达水平与TNF-诱导VSMC迁移过程的相关性规律。分别构建UCH-L1高表达和UCH-L1 RNA干扰表达的腺病毒载体以调节VSMC中UCH-L1的表达水平,观察细胞内UCH-L1水平对生理状态及TNF-诱导状态下VSMC迁移能力的影响。UCH-L1高表达的VSMC经TNF-处理不同时间后,用Westen Blot法检测NF-κB的两种抑制蛋白IκB和IκB?的蛋白水平变化,观察UCH-L1对IκB和IκB?蛋白降解过程的影响。采用脂质体转染方式分别将UCH-L1表达载体质粒、IκB或IκB?表达载体质粒与NF-κB荧光素酶报告基因质粒共转染大鼠大动脉平滑肌细胞系（A7r5细胞）,用TNF-处理细胞6h以激活细胞内NF-κB的转录,用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶的相对活性,观察UCH-L1与IκB或IκB?的表达分别或同时升高对NF-κB转录活性水平的影响,研究IκB和IκB?在UCH-L1调节NF-κB活性过程中的作用,并进步用免疫共沉淀的方法验证UCH-L1分别与IκB和IκB?蛋白间的相互作用。结果: TNF-对VSMC迁移的诱导作用具有明确的剂量和时间依赖关系。当TNF-诱导浓度为10ng/ml时,VSMC迁移效率最高;且随着TNF-诱导时间延长VSMC迁移逐渐增加。细胞划痕实验中,TNF-诱导12h时划痕间距显著变小（P<0.05）,至48h时划痕间距几近消失,细胞迁移至完全融合状态。TNF-诱导VSMC迁移过程中,细胞内UCH-L1蛋白表达水平在TNF-诱导12h后显著升高（P<0.05）,并随诱导时间延长呈逐渐升高的趋势,且在诱导36h时达到最高峰。腺病毒载体感染VSMC后,发现UCH-L1表达升高可以明显抑制生理状态和TNF-诱导状态下的VSMC迁移能力,而UCH- L1表达降低使VSMC迁移能力明显增强。进步观察TNF-作用下VSMC内IκB和IκB?蛋白水平,可见其随诱导时间延长逐步下降,而UCH-L1高表达可显著抑制IκB和IκB?水平的下降,提示IκB和IκB?是UCH-L1介导的NF-κB活性抑制中的主要作用靶点。分别将UCH-L1表达载体、IκB或IκB?表达载体与NF-κB报告基因载体共转染A7r5细胞后,发现UCH-L1表达升高能明显抑制生理状态和TNF-诱导状态下NF-κB转录因子活性;UCH-L1与IκB同时高表达对NF-κB活性抑制效应产生协同作用而更强,与IκB?同时高表达时UCH-L1对NF-κB活性的抑制效应影响不明显。免疫共沉淀实验确认了UCH- L1与IκB?之间存在相互作用,与与IκB之间未发现相互作用。结论: UCH-L1抑制TNF-诱导的VSMC迁移,其通过减缓细胞中IκB和IκB?的降解,维持细胞内IκB和IκB?对NF-κB活性的负调控,实现了对VSMC迁移的TNF- /IκB和IκB?/NF-κB信号调控通路的阻抑。