论文摘要
1、背景周期依赖性蛋白激酶5（cyclin-dependent kinase 5, Cdk5）是Cdks家族的成员之一,属于丝氨酸／苏氨酸激酶家族,由于Cdk5具有与其他Cdk成员同源序列而得名,p35是其主要激活剂。Cdk5/p35最初是从牛脑中分离并提炼而来的。Cdk5的表达是随着大脑的发育而增加,在成年大鼠中cdk5的表达达到最高,p35的表达从大鼠出生到第二周表达都最高,在成年大鼠大脑中p35的表达呈有意义的减少。在大鼠大脑发育的各个阶段,p35的表达和cdk5的活性有着密切的关系,但是与Cdk5的表达无关联。这提示了Cdk5的活性依赖于p35的表达,p35的表达调节着Cdk5的活性。有研究表明,p35表达缺失的小鼠,会使cdk5的活性受到影响,另一种激活剂p39应急性的上调也不能完全代替p35的功能。p35和p39都缺陷的小鼠,Cdk5则没有激酶活性,其与Cdk5缺陷小鼠一样,说明至少在小鼠发育过程中,不论是否存在cdk5其他调节因子,p35对cdk5活性调节的影响是不能完全被其他分子蛋白所替代的。此外,神经细胞培养表明,Cdk5和p35的过度表达诱发神经突的生长。2006年,有学者用p35基因敲除小鼠模型（p35-/-小鼠）及p35过表达模型（Tgp35小鼠）,与野生型WT小鼠对照,发现Cdk5活性明显下降的p35-/-小鼠,对热刺激引起的疼痛反应也明显延迟；Cdk5水平明显上调的Tgp35小鼠,对热刺激引起的疼痛出现过敏反应。Cdk5/p35被证明参与神经系统疼痛信号传递的调节,Cdk5/p35的过度表达能增加大量突触结构,并且使得突触后的活性大为提高。表明Cdk5的激活剂p35过度表达能够引起突触结构的增加和对疼痛反应的过敏,并且还能调节突触前、后区蛋白物质表达,从而影响神经递质的释放和受体的结合。三叉神经痛（Trigeminal neuralgia, TN）是指在三叉神经分布区域内出现阵发性电击样剧烈疼痛,历时数秒至数分钟,间歇期无症状。疼痛可由口腔或颜面部的任何刺激引起。以中老年人多见,多数为单侧性。到目前为止,TN的发病机制仍不明了,确切的动物模型还难以建立。国内外学者普遍认为周围因素是TN的主要致病因素,周围因素中的血管压迫学说获得决大部分学者的认同,因此,动物模型大多是通过结扎眶下神经模拟血管压迫,并在眶下神经支配处表面皮肤进行机械刺激,模拟三叉神经痛扳机点。三叉神经脊束核（Spinal trigeminal caudal subnucleus, Vc）位于延髓的外侧及三叉神经脊束的内侧,从外到内有五层。三叉神经脊束核是颌面部组织伤害性刺激想中枢传导的第一门户,尾侧亚核和相邻的区域是感受躯体感觉的初级中枢,传递着颌面部的伤害性刺激信息。因此我们采用Vc组织来检测Cdk5/p35的表达与活性。综合上述的研究背景,本实验制备了三又神经痛大鼠模型并检测了各组三叉神经痛大鼠模型中Cdk5和p35的表达与活性变化。2、目的我们假设Cdk5/p35存在于大鼠TN模型Vc内的神经元中,由于尚无Cdk5/p35在该模型中如何发挥作用方面的阐述,而且三叉神经的感觉神经传入延髓下段的Vc神经元,因此我们考虑将眶下神经慢性缩窄性伤害（chronic constriction injury on the infraorbital branch of the trigeminal nerve, ION-CCI）的大鼠作为TN的实验研究模型,检验ION- CCI后大鼠Vc组织中Cdk5/p35的表达和Cdk5的活性,为研究Cdk5/p35与TN发病机制的关联性打下实验基础。3、材料与方法3.1实验动物分组同一批SD雄性大鼠,体重为180g,36只随机分为6组,分为正常组,假手术组,ION-CCI 1d组,ION-CCI 3d组,ION-CCI 7d组,ION-CCI 14d组。大鼠由南方医科大学珠江医院动物实验室以常规固体饲料饲养,自由饮水,湿度40%-50%。3.2眶下神经结扎术正常组不需做任何处理,假手术组只暴露眶下神经后缝合伤口,其余手术组暴露一侧眶下神经并结扎,但保持神经微血管循环,缝合伤口。3.3眶下神经标本和Vc组织标本的制取根据分组标志分别称取大鼠体重,按350mg/kg体重腹腔注射水合氯醛麻醉后,取结扎区眶下神经进行HE和weil氏染色观察。根据Paxinos和Watson的大鼠脑立体定位图谱定好Vc坐标位置切取大鼠Vc组织块,分别放入相应标记好的试管,放入-80℃冰箱冻存。3.4 Vc组织抗原蛋白的提取按标记试管取出组织块,将其放入匀浆器内,加入细胞裂解缓冲液后,将匀浆器置于冰上进行彻底匀浆后,将匀浆液移至离心管后,在4℃下,12000rpm离心5min,提取其上清液装于已经标记好的离心管中,放入-20℃冰箱保存。3.5 Vc组织上清液蛋白含量的测定3.6 Cdk5的Western blotting检测3.7 p35的Western blot检测3.8 Cdk5的免疫沉淀和酶活性分析3.9实验各组大鼠得出Cdk5和p35的OD值及Cdk5的活性值运用SPSS13.0统计软件进行统计分析,采用单因素方差分析（one-way ANOVA）,先进行方差齐性检验,如方差齐性运用LSD检验进行多重比较；如果方差不齐,则用Dunnett’s进行多重比较。4、结果（1） ION-CCI呈时间依赖形式诱导大鼠神经损伤侧Vc组织中的p35上调；（2）Cdk5的表达在各实验组之间比较无显著性差异,而Cdk5的活性和p35的表达具有一致性,并且与p35的上调曲线一样呈递增趋势。Cdk5的活性和p35的表达具有一致性,并且呈递增趋势,ION-CCI第14天Vc组织中的Cdk5活性（114 Kcpm）是ION-CCI第1天Vc组织中Cdk5活性（68 Kcpm）的2倍,各组之间均有显著差异（P<0.01）5、结论（1）实验各组大鼠Vc组织中,Cdk5的活性变化与Cdk5的蛋白表达无关联性；（2）实验各组大鼠Vc组织中,Cdk5的活性与p35的表达具有一致性。