论文摘要
结肠直肠癌是世界范围内最普遍的癌症之一,严重威胁着公众健康。大量临床资料显示,进展期及晚期结肠直肠癌预后较差,而早期结肠直肠癌的治愈率则较高。故及时准确地发现癌前病变和早期癌,为患者争取最佳治疗时间,是提高该病治愈率及生存质量的关键。然而,本病在早期往往由于缺乏自觉症状及有效的诊断措施而被延误并失去治愈机会。故而,寻找一种简便、快捷且有效、实用的早期诊断方法或指标成为该病临床及基础研究的热点。随着有关结肠直肠癌早期诊断研究的深入,其早期诊断的内涵已由发现体积较小的癌肿,延伸为诊断刚形成或发生的癌前病变及癌肿。研究显示,结肠直肠癌患者的复发和死亡率与其最初诊断分期密切相关,因此通过筛查,早期发现并及时干预将有利于提高该病的治愈率和生存质量,降低其死亡率。目前,用于早期筛查的方法很多,如大便潜血试验（FOBT）、结肠镜、可屈性乙状结肠镜检查及双重对比钡剂灌肠法等。其中FOBT和结肠镜在临床上较常用。大便潜血试验廉价、操作简便、易于接受,但敏感性和特异性较低;结肠镜结合组织活检是最准确、可靠的诊断方法,但由于成本高、发生操作相关并发症的危险性高,而使其无法得到普及作为筛查指标。肿瘤血清标志物的检测,由于其没有侵入性、操作方便、经济实用,在癌症的早期诊断和普查中具有极大的挖掘潜力及应用前景。为此,在肿瘤基础和临床研究领域肿瘤标志物多年来一直备受关注。在研究者们的共同努力下,已经为消化道肿瘤的诊断找到几种比较可靠的血清标志物,如AFP、CEA等已经广泛用于消化道肿瘤的筛查。但这些常用于消化道肿瘤诊断的血清标志物在敏感性和特异性方面一直不能满足实际需要,而不适用于结肠直肠癌的早期诊断。如目前使用较多的CEA:Luis.A等对209例结肠直肠癌患者进行CEA检测,以5ng/ml为基线,敏感性只有40%（83例阳性）,提示CEA不适于结肠直肠癌的早期诊断。为此寻找一种诊断结肠直肠癌特异性血清标志物势在必行。近期MarkusRoeBler等报道16例病人的结肠直肠癌组织和正常组织进行双向电泳（2-DE）分析,并通过质谱发现了肿瘤相关蛋白PA28γ在结肠直肠癌组织中高表达,Western-blot和免疫组化也证实了这一点。PA28γ即蛋白酶体激活亚单位3,又名PSME3、REGγ、Ki antigen,分子量约为29.5kDa,主要定位于胞核。WolfgangRollinger等又通过检测109例结肠直肠癌患者、87例良性肠疾病患者和317例健康对照的血清PA28γ水平,经统计分析发现结肠直肠癌患者的PA28γ水平与良性肠疾病和正常人相比均有显著性差异。而RPA28γ在血清中的含量与正常人的年龄无关,其丰度也与样本的病理阶段无关。在对109例结肠直肠癌病人和317例正常人做ROC曲线（receiver-operating characteristic curve）分析表明:在结肠直肠癌的诊断中PA28γ比CEA有更高的诊断价值,因此PA28γ能否用于结肠直肠癌的诊断很值得我们研究和证实。另外,Nikaido等认为PA28γ的表达可能与细胞的转化和生长调节有关,当A31细胞被诱导分裂时PA28γ的表达量上升10倍。Murata等发现已敲除该基因的小鼠没有明显的生理损伤,但生长速度比正常小鼠慢,且体型较小;另外发现敲除PA28γ基因后,胚胎成纤维细胞的生长速度和饱和密度均下降,并阻止细胞周期进入S期。此外,Wolfgang Rollinger等对109例结肠直肠癌的患者进行研究,手术切除的肿瘤组织和周围的正常组织为标本做双向电泳,对胶上所有的点做基质辅助激光解析电离飞行时间质谱,发现一种差异表达的蛋白:NNMT。他们通过检测109例结肠直肠癌病人和317例健康对照测血清中NNMT和CEA浓度,通过ROC曲线（receiver-operating characteristic curve）发现NNMT和CEA曲线下面积分别为0.84和0.78,显示NNMT的血清水平可能在结肠直肠癌病人的早期检测与监测方面有重要意义。NNMT即尼克酰胺N-甲基转移酶（EC2.1.1.1）,其基因位于人类第11号染色体,NNMT的主要生理作用是催化尼克酰胺的甲基化和其它吡啶衍生物如吡啶、喹林、β咔林等的甲基化,在药物和一些外来化学物质的生物转化中起重要作用。NNMT定位于细胞浆,但在血清中也能检测到。研究发现NNMT在肿瘤组织中含量明显增高,如结肠直肠癌、乳头状甲状腺癌、肾透明细胞癌及胃癌等,提示NNMT可能和肿瘤的发生有关,检测组织或体液中NNMT的含量有助于肿瘤的早期诊断和鉴别诊断。为此,本课题拟通过制备抗NNMT和抗PA28γ的单克隆抗体,为进一步的结肠直肠癌血清学筛查打下基础,进一步去评价与CEA在结肠直肠癌诊断中的差异及价值,了解检测血清中的NNMT和PA28γ是否在敏感性和特异性上优于CEA,探讨其在结肠直肠癌早期诊断中的可靠性和可行性。同时进一步去探讨PA287与细胞的转化、生长调节的关系,NNMT与肿瘤发生的关系。本研究分别从结肠直肠癌细胞株（Lovo）和人正常肝细胞中成功扩增并克隆出PA28γ和NNMT基因片段,将所得的目的基因克隆至pGEX-4T-1表达载体,并在大肠杆菌中进行了大量表达。采用亲和层析法和分子筛纯化融合蛋白,PA28γ融合蛋白和NNMT融合蛋白使用抗GST的抗体进行Westen-blot鉴定后免疫小鼠制备其对应的单克隆抗体,分别用ELISA、Western-blot法检测和鉴定单克隆抗体。同时使用我们制备的单克隆抗体通过免疫荧光方法观察PA28γ蛋白在真核细胞中的定位情况。结果显示,利用RT-PCR技术成功克隆了PA28γ和NNMT基因,经测序并与GenBank中序列进行比对,结果完全一致,大小分别为765bp和795bp。并且将PA28γ和NNMT基因分别克隆到pGEX-4T-1原核表达载体,经PCR、限制性酶切分析和测序等鉴定,成功构建了pGEX-4T-1/PA28γ和pGEX-4T-1/NNMT重组原核表达质粒。重组质粒pGEX-4T-1/PA28γ和pGEX-4T-1/NNMT分别在大肠杆菌中表达出PA28γ与谷胱甘肽S-转移酶（GST）的融合蛋白和NNMT与谷胱甘肽S-转移酶（GST）的融合蛋白,且表达产物均部分以可溶性形式存在。重组蛋白分子量分别约为56.4kDa和56.5kDa,与理论值基本符合。表达量分别约占菌体总蛋白的20%和30%,重组蛋白经过纯化后,纯度均达80%以上。用抗GST抗体对表达产物进行Western-blot分析,发现特异性区带出现在56.4kDa和56.5kDa处,表明该蛋白确实是所要表达的GST融合蛋白。进一步用纯化的表达产物免疫小鼠制备免疫血清,ELISA分析表明重组蛋白能与该免疫血清起反应,而与正常小鼠血清不发生交叉反应,说明重组蛋白具有抗原活性。用纯化的表达产物PA28γ-GST免疫小鼠制备了3株单抗,用纯化的表达产物NNMT-GST免疫小鼠制备了5株单抗,分别以纯化重组蛋白PA28γ-GST和NNMT-GST为抗原,使用ELISA法检测单抗细胞株培养上清的效价,OD值均在1:1000以上。Western-blot结果显示:抗GST-PA28γ的单抗与肝癌细胞株（HepG2）内提取的天然蛋白发生特异性反应,特异性条带出现在分子量约为31kDa处,与文献报道一致;抗NNMT-GST的5株单抗与结肠直肠癌细胞株（Lovo）内提取的天然蛋白发生特异性反应,特异性条带分子量约为29.6kDa,与预计值完全相符,而对照组则无明显条带出现。说明制备的单抗均为特异性单抗。免疫荧光实验结果发现PA28γ在亚细胞结构中主要定位于细胞核,小部分定位于细胞浆。以上结果表明,我们已经成功地构建了pGEX-4T-1/PA28γ和pGEX-4T-1/NNMT原核重组表达质粒,目前国内尚未见关于PA28γ原核重组并表达的报导。而且在大肠杆菌中大量表达出具有免疫活性的可溶性重组蛋白PA28γ和NNMT;筛选并建立了多株分泌抗PA28γ单克隆抗体的杂交瘤细胞株和抗NNMT单克隆抗体的杂交瘤细胞株,为进一步研究这两种蛋白的功能、在人肿瘤的发生发展中所起的作用、对结肠直肠癌早期的潜在诊断价值的验证奠定基础。