抗吡虫啉—甲基对硫磷双特异性单克隆抗体的研究

论文摘要

吡虫啉和甲基对硫磷是农业生产中被广泛使用的杀虫剂,吡虫啉属于新型烟碱类杀虫剂,主要用于防治水稻、玉米等作物上的刺吸式口器害虫,而甲基对硫磷属于有机磷酸酯类杀虫剂,用于防治苹果、棉花等作物上的害虫。这两种农药在农业生产中的不当使用已经严重危害到环境质量和人类健康,因此,建立一个针对这两种农药的快速、经济、灵敏的残留分析方法已势在必行。酶联免疫分析技术（ELISA）因其比传统的仪器分析方法具有操作简便、价格低廉、适宜现场监控和大量样品筛选等优点,在农药残留快速检测中发挥着重要的作用。本文先利用杂交瘤制备技术成功获得了抗吡虫啉单克隆抗体,在此基础上,利用杂交-杂交瘤制备技术进行细胞二次融合,获得了抗体吡虫啉-甲基对硫磷双特异性单克隆抗体,并分别建立起了基于两种抗体的ELISA检测体系。具体如下：本研究首先以吡虫啉为研究对象,采用分子模拟技术分析了吡虫啉及其类似农药的电荷分布,选择1-[6-（2-羧乙硫基-3-吡啶）甲基]-N-硝基-2-咪唑啉亚胺（H1）作为免疫半抗原,1-（6-氯-3-吡啶甲基）-3-羧丙基-N-硝基-2-咪唑啉亚胺（H2）作为包被半抗原,利用NHS酯法将H1和H2分别与牛血清蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）偶联合成免疫原与包被原。免疫BALB/c小鼠后,采用常规杂交瘤技术共获得2株稳定分泌抗吡虫啉单克隆抗体的细胞株2F11/A9和2G6/G12,其分泌的抗体类型分别为IgG3和IgG1,与吡虫啉形成的抗原-抗体复合物的电离常数分别为1.1×10-10mol/L和3.4x 10-9mol/L。随后,选择2F1 1/A9分泌的抗体进行了ELISA分析方法的建立,通过研究有机溶剂、离子强度、pH值对抗原抗体反应灵敏度的影响,优化了吡虫啉间接竞争酶联免疫吸附测定（IC-ELISA）的分析条件,确定了含5%丙酮的PBST、0.2 M的离子强度、8.0的pH值作为吡虫啉IC-ELISA的最佳工作条件。利用优化后的分析条件,用IC-ELISA法进行了方法灵敏度、特异性和准确度的分析,结果表明,检测体系的IC50为5.3 ng/mL,检测限为1.1 ng/mL,与6种吡虫啉的结构类似物均无明显的交叉反应。添加回收试验表明该方法可以用于自来水、土壤和包菜样品中吡虫啉农药残留的检测,添加回收率为85.5%-118.0%,变异系数为1.0%-4.7%。在此基础上,本研究对分泌抗吡虫啉抗体的杂交瘤细胞株2F11/A9在5-溴-2-脱氧尿苷（5-BrdU）培养基中培养,使细胞胸苷激酶（TK）缺失；对分泌抗甲基对硫磷的杂交瘤细胞株（实验室先前制备保存）在8-杂氮鸟嘌呤（8-AG）培养基中培养,使细胞次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）缺失。然后采用三体杂交瘤和四体杂交瘤制备技术分别获得了一株能分泌抗吡虫啉-甲基对硫磷的双特异性单克隆抗体的三体杂交瘤细胞（LG-D6）和四体杂交瘤细胞（LG-A2）。将LG-D6制备腹水,通过一系列的反应缓冲体系的筛选和优化,建立了相应ELISA方法。从灵敏度结果可知,双特异性单克隆抗体对吡虫啉和甲基对硫磷的检测灵敏度分别为69.8 ng/mL和1.9ng/mL。交叉反应率实验结果表明所制备的双特异性单克隆抗体除与氯噻啉、对硫磷、杀螟硫磷有交叉反应之外,与其余的结构类似物均无明显交叉反应。对水质样品中的吡虫啉和甲基对硫磷进行添加回收率试验,添加回收率均在87.4%-104.0%之间,表明所建立的免疫分析方法准确可靠。通过以上试验研究,本文建立起了吡虫啉残留免疫学检测方法并初步提出了较为系统的基于杂交-杂交瘤技术的双特异性单克隆抗体制备技术体系、建立了相应的ELISA分析方法,为相关免疫检测产品的研发奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词说明
• 第一章 文献综述
• 第一节 农药残留检测技术现状分析
• 1 农药残留现状
• 2 农药残留检测技术研究进展
• 2.1 理化分析法
• 2.2 免疫分析法
• 2.3 光谱法
• 2.4 酶抑制法
• 2.5 免疫传感器技术
• 3 总结
• 第二节 农药小分子抗体制备研究进展
• 1 半抗原的设计与合成
• 1.1 半抗原的设计原则
• 1.2 分子模拟技术在半抗原设计中的应用
• 1.3 异质半抗原的使用
• 2 多克隆抗体及单克隆抗体的制备
• 3 基因工程抗体的应用
• 第三节 农药多残留免疫分析技术研究进展
• 1 复合免疫法
• 2 通用半抗原法
• 3 双特异性抗体法
• 3.1 化学偶联法
• 3.2 基因工程法
• 3.3 杂交-杂交瘤法
• 第二章 抗吡虫啉单克隆抗体的研制
• 第一节 人工抗原的合成与鉴定
• 1 试验材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要仪器设备
• 2 试验方法
• 2.1 半抗原的设计、合成与鉴定
• 2.2 人工抗原的合成与鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 分子模拟结果及半抗原的选择
• 3.2 半抗原结构鉴定
• 3.3 人工抗原偶联鉴定
• 4 讨论
• 第二节 杂交瘤细胞株的制备与筛选
• 1 试验材料
• 1.1 生物材料
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器设备
• 2 试验方法
• 2.1 人工免疫原的制备
• 2.2 人工包被原的制备
• 2.3 小鼠免疫
• 2.4 融合小鼠的选择
• 2.5 杂交瘤细胞的制备
• 2.6 杂交瘤细胞的冻存与复苏
• 2.7 杂交瘤细胞染色体核型分析
• 2.8 单克隆抗体的大量制备
• 2.9 单克隆抗体类型鉴定
• 2.10 单克隆抗体与农药复合物电离常数的测定
• 2.11 单克隆抗体的稳定性
• 3 结果与分析
• 3.1 融合小鼠的选择
• 3.2 杂交瘤细胞株的建立及抗体类型鉴定
• 3.3 杂交瘤细胞染色体核型分析
• 3.4 腹水制备和效价测定
• 3.5 单克隆抗体与农药复合物电离常数的测定
• 3.6 单克隆抗体稳定性测定
• 4 讨论
• 4.1 细胞融合技术
• 4.2 细胞单克隆化
• 第三节 吡虫啉残留免疫分析方法的建立
• 1 试验材料
• 1.1 试剂
• 1.2 仪器设备
• 2 试验方法
• 2.1 包被原的合成
• 2.2 抗体的准备
• 2.3 吡虫啉酶联免疫分析条件的优化
• 3 结果与分析
• 3.1 包被原与抗体工作浓度优化
• 3.2 有机溶剂的选择
• 3.3 离子强度对体系的影响
• 3.4 pH值对体系的影响
• 3.5 标准曲线的建立
• 3.6 交叉反应率
• 3.7 添加回收实验
• 4 讨论
• 第三章 双特异性单克隆抗体的研制
• 1 试验材料
• 1.1 生物材料
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器设备
• 2 试验方法
• 2.1 吡虫啉人工免疫原的制备
• 2.2 吡虫啉及甲基对硫磷人工包被原的制备
• 2.3 小鼠免疫及融合小鼠的选择
• 2.4 三体杂交瘤细胞的制备
• 2.5 四体杂交瘤细胞的制备
• 2.6 杂交-杂交瘤细胞染色体核型分析
• 2.7 双特异性单克隆抗体类型鉴定
• 2.8 腹水的制备
• 2.9 ELISA分析方法的建立
• 3 结果与分析
• 3.1 HGPRT酶和TK酶缺陷型细胞株的筛选
• 3.2 融合小鼠的选择
• 3.3 杂交-杂交瘤细胞株的建立及抗体类型鉴定
• 3.4 杂交-杂交瘤细胞株染色体核型分析
• 3.5 腹水制备和效价测定
• 3.6 ELISA工作浓度的优化
• 3.7 有机溶剂对检测体系的影响
• 3.8 pH值对检测体系的影响
• 3.9 离子强度对检测体系的影响
• 3.10 标准曲线的建立
• 3.11 交叉反应
• 3.12 添加回收率的测定
• 4 讨论
• 4.1 双特异性单克隆抗体制备技术
• 4.2 三体杂交瘤和四体杂交瘤制备方法的比较
• 4.3 双特异性单克隆抗体的应用
• 全文总结
• 参考文献
• 附录
• 附录Ⅰ ELISA试剂及细胞培养液配制方法
• 附录Ⅱ 化合物结构鉴定核磁图
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文和申请的专利