变异甲型H1N1流感病毒疫苗候选株的构建研究

论文摘要

流感（influenza）是由流感病毒（influenza virus, IV）引起的一种高度传染性呼吸道疾病。在美国,每年估计有2500万至5000万流感患者,导致平均22.5万人住院治疗,在过去的三十年中,据估计每年由流感引起的相关死亡人数在3349到48614人之间,大多数的死亡（>90%）病例为健康状况较差的老年人。据此,世界卫生组织（WHO）统计,全球每年流感可引起10亿人感染,其中重症病例约300万～500万,并导致30万～50万人死亡。历史上最严重的流感大流行是发生在1918年的西班牙流感大流行,共夺走了至少5000万人的生命。1933年首次从人体内分离得到流感病毒,包含8个RNA片段,编码11个蛋白。流感病毒分为甲、乙、丙三型,甲型和乙型流感每年都会在人群中流行。一种新型流感病毒在人群中暴发,即可以通过直接的跨种传播,也可以通过现有毒株的分子改变。流感病毒含有8个基因片段,当有两个或者两个以上的毒株共同感染同一个宿主细胞时,可导致病毒的基因重排,发生抗原转变产生新的病毒。如果人群中没有针对新病毒HA蛋白的免疫抗体,且病毒具有有效的复制能力和快速的人传人的传播能力,就可导致流感大流行,如2009年的甲型H1N1流感大流行。流感病毒的另一个主要特点是聚合酶的错配,常导致病毒表面糖蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的基因突变,HA蛋白的基因突变增加了人们对流感病毒的易感性,并促使现有季节性流感疫苗的不断更新。甲型H1N1大流行流感病毒已变成季节性流感不断在人群中流行,为应对其可能发生的抗原变异,我们开展了下列研究。本研究对当前流行的甲型H1N1流感病毒进行分离与鉴定,成功分离得到一株甲型H1N1流感病毒株（A/Changchun/01/2009（H1N1））,并完成了全基因序列测定,通过系统进化分析显示,该毒株属于甲型H1N1流感病毒流行分支2,为甲型H1N1流感中后期的优势毒株；实验室研究表明,在抗体压力下,A/Changchun/01/2009（H1N1）的血凝素HA基因发生变异,可引起抗原改变。为研制针对变异株的疫苗候选株,本研究以鸡胚高度适应株A/PR/8/34（HIN1）的6个内部基因（PB2、PB1、PA、NP、M、NS）为骨架,以所分离的毒株A/Changchun/01/2009（H1N1）的表面抗原血凝素（HA）基因和神经氨酸酶（NA）基因为供体,利用流感病毒反向遗传学技术成功拯救了甲型H1N1流感病毒疫苗株PR8-XD,并通过对血凝素（HA）基因进行点突变后,成功获得变异甲型H1N1流感病毒疫苗候选株PR8-XD-Mu。进一步利用小鼠模型评价疫苗株PR8-XD和PR8-XD-Mu的免疫原性和攻毒保护效力。PR8-XD和PR8-XD-Mu经肌肉免疫后,2周就可产生血凝抑制（HI）抗体,4周后针对同源病毒血凝抑制（HI）抗体水平达到128；同时,以100MLD50的甲型H1N1流感病毒变异株UI-182对疫苗免疫4周后的小鼠进行攻毒保护试验,试验结果表明,小鼠经疫苗株PR8-XD和PR8-XD-Mu免疫后,均可抵抗变异株UI-182的攻击,保护率达100%。本研究对鸡红细胞进行戊二醛醛化,醛化后进行冷冻真空干燥,获得冻干红细胞产品,冻干红细胞复水后,细胞形态完整,可代替新鲜的红细胞进行血凝（HA）和血凝抑制（HI）实验,冻干红细胞可于4℃条件下保存8个月以上,其稳定性不变。本研究成功分离得到一株甲型H1N1流感病毒A/Changchun/01/2009（H1N1）,分子进化分析显示该毒株属于甲型H1N1流感病毒流行分支2,为甲型H1N1流感流行中后期的优势毒株,在抗体压力下,其血凝素HA基因发生变异,可引起抗原改变。为研制针对抗原变异株的疫苗候选株,利用流感病毒反向遗传学技术成功拯救获得了流感疫苗株PR8-XD和变异甲型H1N1流感病毒疫苗候选株PR8-XD-Mu,并在小鼠模型上显示出良好的免疫原性和保护效力,可作为变异甲型H1N1流感病毒疫苗候选株的参考毒株,也为疫苗候选株的构建提供了参考依据；同时,制备的冻干红细胞,可完全代替新鲜的鸡红细胞进行血凝（HA）和血凝抑制（HI）实验,具有良好的稳定性,对于促进以红细胞凝集为指示系统的诊断技术的发展与应用具有重要意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一篇 文献综述
• 1 流感病毒概述
• 1.1 流感病毒生物学特征
• 1.2 流感流行现状
• 1.3 流感病毒遗传与变异
• 1.4 结语
• 2 流感疫苗研究进展
• 2.1 灭活疫苗
• 2.2 流感减毒活疫苗（live attenuated influenza vaccine,LAIV）
• 2.3 病毒样颗粒（Virus-like Particles）
• 2.4 病毒载体（Viral Vectors）
• 2.5 DNA疫苗（DNA-Based Vaccines）
• 2.6 通用疫苗（“Universal” Vaccines）
• 2.7 佐剂疫苗
• 2.8 以细胞为基质制备流感疫苗
• 2.9 结语
• 3 反向病毒学技术在流感疫苗研究中的应用
• 3.1 反向遗传学基本概念
• 3.2 流感病毒反向遗传学技术的建立及发展
• 3.3 流感病毒反向遗传学技术在疫苗研究中的应用
• 3.4 结语
• 4 本研究的目的及意义
• 第二篇 实验研究
• 第1章 甲型H1N1流感病毒分离鉴定及分子进化分析
• 1.1 材料与方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 第2章 变异甲型H1N1流感病毒疫苗候选株的构建
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 第3章 疫苗候选株的生物学评价
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 第4章 鸡红细胞的醛化与冻干研究
• 4.1 材料与方法
• 4.2 结果
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 第5章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历