人TRAIL基因cDNA的克隆及真核和原核表达载体的构建

论文摘要

目前,肿瘤已成为引起人类死亡的主要病因,基因疗法有可能成为继手术、放疗和化疗等之后应用于肿瘤治疗的新手段。肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体即TRAIL 可诱导多种肿瘤细胞凋亡,而对正常组织细胞无凋亡诱导作用且无毒副作用,它将对肿瘤的靶向性和治疗性集于一体,有可能成为肿瘤的基因治疗中较为理想的治疗基因和新一代广谱抗癌药物。为了探讨TRAIL引起细胞凋亡的机制以及将其用于基因治疗和作为抗肿瘤药物进行开发的前景。我们进行了关于人TRAIL 基因cDNA 的克隆及真核和原核表达载体构建的课题研究,结果如下: 1. 通过RT-PCR 方法从人胎盘组织中扩增出长度为1 039bp 的人TRAIL 基因的cDNA 序列,PCR产物经凝胶回收纯化后,克隆在pGEM-T Easy 载体的T 位点,命名为T-TRAIL。测序结果和序列分析显示,本研究成功地克隆了TRAIL 基因的全长cDNA。2.用NotⅠ分别酶切消化T-TRAIL 和质粒pIRESneo3,消化后的质粒pIRESneo3 直接进行5′端去磷酸化反应,后与用琼脂糖凝胶回收的TRAIL 片段经T4 DNA连接酶连接在一起。用PCR 方法和酶切方法检测,结果表明成功构建了具有核糖体进入位点和CMV 强启动子的人TRAIL 基因的真核表达载体。3.以克隆好的TRAIL 全长cDNA 为模板,以带有BamH I 和Xho I 酶切位点的引物扩增了560bp 的TRAIL 可溶性胞外区片断,并将其和质粒PET-28a 相连,结果成功构建了人sTRAIL 基因的原核表达载体。4.将重组质粒转化大肠杆菌BL21 菌株,经IPTG 诱导,SDS-PAGE 检测,TRAIL蛋白得到了高效表达。超声破碎表达菌,离心后收集沉淀及上清液,SDS-PAGE 鉴定,结果表明表达蛋白大部分以包涵体形式存在。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 文献综述
• 第一章 肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）的研究
• 1.1 TRAIL及其受体
• 1.1.1 TRAIL及其受体的发现
• 1.1.2 人TRAIL基因的分子结构
• 1.1.3 TRAIL的受体
• 1.1.4 TRAIL诱导细胞凋亡的机制
• 1.1.5 正常细胞逃逸TRAIL杀伤作用的机制
• 1.2 TRAIL在肿瘤治疗中的应用
• 1.2.1 TRAIL作用的特点
• 1.2.2 TRAIL基因与免疫系统
• 1.2.3 TRAIL在肿瘤治疗中的应用
• 1.2.4 增强癌细胞对TRAIL敏感性的策略
• 1.2.5 TRAIL的国内外研究现状
• 1.2.6 TRAIL在肿瘤治疗中潜在的局限性
• 试验研究
• 第二章 人TRAIL基因cDNA克隆与序列分析的研究
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 组织来源
• 2.1.2 质粒和菌种
• 2.1.3 试剂和仪器
• 2.1.4 总RNA提取
• 2.1.5 RNA的甲醛凝胶变性电泳
• 2.1.6 特异性引物设计
• 2.1.7 RT-PCR反应
• 2.1.8 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳及产物纯化
• 2.1.9 扩增产物的T-A克隆
• 2.1.10 用内切酶NotⅠ酶切鉴定重组质粒
• 2.1.11 目的片断序列测定
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 人胎盘组织总RNA的完整性
• 2.2.2 人TRAIL基因cDNA的扩增
• 2.2.3 重组质粒酶切鉴定
• 2.2.4 人TRAIL基因cDNA核苷酸序列分析结果
• 2.3 讨论
• 2.4 结论
• 第三章 人TRAIL基因的真核和原核表达载体的构建
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 质粒和菌种
• 3.1.2 试剂和仪器
• 3.1.3 人TRAIL基因的真核表达载体构建
• 3.1.4 人TRAIL基因的原核表达载体的构建方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 人TRAIL基因的真核表达载体构建的鉴定结果
• 3.2.2 可溶性TRAIL的扩增结果
• 3.2.3 人TRAIL基因的原核表达载体构建的鉴定结果
• 3.3 讨论
• 3.4 结论
• 第四章 TRAIL蛋白在大肠杆菌中表达的初步研究
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 sTRAIL蛋白的SDS-PAGE鉴定
• 4.2.2 菌体超声后上清与沉淀的鉴定结果
• 4.3 讨论
• 4.4 结论
• 参考文献
• 附图
• 致谢
• 作者简介