论文摘要
胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor,IGF）和一些与它相关的成分构成了一个复杂的生长因子家族,它们对早期胚胎发育的调节起着重要的作用。本研究主要通过RT-PCR方法和免疫荧光标记检测了IGF-Ⅰ、Ⅱ和IGF-ⅠR、ⅡR在牛卵母细胞、早期胚胎中的表达情况;在成熟培养液和发育培养液中添加不同剂量的IGF-Ⅰ、Ⅱ,观察其对卵母细胞和胚胎发育的影响;采用RNAi的方法进一步探讨了IGF-ⅠR在牛早期胚胎发育中的作用。一、IGF-Ⅰ、Ⅱ和IGF-ⅠR、ⅡR mRNA在牛卵母细胞和早期胚胎中的表达通过RT-PCR的方法检测了IGF-Ⅰ、Ⅱ和IGF-ⅠR、ⅡR mRNA在卵母细胞、早期胚胎中的表达情况。结果显示在卵母细胞和早期胚胎中均检测到IGF-Ⅱ和IGF-ⅠR、ⅡR mRNA的表达;但是始终未检测到IGF-ⅠmRNA的表达。二、IGF-Ⅱ和IGF-ⅠR、ⅡR在牛卵母细胞和早期胚胎中的表达本研究首次对IGFs蛋白在牛卵母细胞和早期胚胎中的表达进行了定位。通过免疫荧光标记和激光共聚焦观察检测IGF-Ⅱ和IGF-ⅠR、ⅡR蛋白在卵母细胞、早期胚胎中的表达情况。结果表明IGF-Ⅱ和IGF-ⅠR、ⅡR的表达情况基本一致:它们在卵母细胞和二细胞期胚胎中主要集中在细胞边缘如膜及膜下区域;并且存在于COC的颗粒细胞中,以及8细胞期胚胎和桑椹胚的整个卵裂球细胞质中;在囊胚的滋养层细胞中可以检测到这些蛋白,但是在内细胞团中没有检测到。三、IGF-Ⅱ对牛卵母细胞成熟的影响本研究首次观察了在牛卵母细胞成熟培养液中添加IGF-Ⅱ对胚胎发育的影响。将采集到的COCs随机平均分成五组,分别成熟培养于含有0（对照）、10、20、50、100 ng/ml IGF-Ⅱ的M199+0.6%BSA的成熟培养液中,经过成熟培养、受精和发育培养后,统计胚胎的发育率和囊胚凋亡细胞数。结果表明各添加组与对照组之间对卵裂率的影响没有显著差异。但是在8细胞胚胎发育率上,20 ng/ml添加组（58.2%）明显高于对照组（44.5%）（P＜0.05）;而且在囊胚发育率方面,20 ng/ml添加组最高（37.0%）,明显高于其他各组（25.0%,33.3%,24.8%,21.2;P＜0.05）。20 ng/ml添加组的囊胚细胞数（126）也明显高于对照组（103,P＜0.05）,但是囊胚细胞中的死细胞比率在各组间没有明显差异。四、IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ对胚胎发育的影响1.添加IGF-Ⅰ对胚胎发育的影响在SOF+PVA培养液中添加不同剂量的IGF-Ⅰ对早期胚胎进行发育培养,培养结果显示,添加0、1、5和10 ng/ml IGF-Ⅰ的8细胞期胚胎发育率和囊胚发育率分别为55.1%、55.1%、62.9%、60.9%和18.9%、19.6%、24.2%、22.7%,结果表明8细胞期胚胎发育率与囊胚发育率在各组之间无显著差异,5 ng/ml组发育效果最好。2.IGF-Ⅱ对早期胚胎发育的影响本研究首次观察了在发育培养液中添加IGF-Ⅱ对胚胎发育的影响。在SOF+PVA培养液中添加不同剂量的IGF-Ⅱ对早期胚胎进行发育培养,发育数据显示,添加0、50、100和150 ng/ml IGF-Ⅱ的8细胞期胚胎发育率和囊胚发育率分别为63.6%、68.9%、61.3%、63.9%和19.2%、21.7%、30%、25.9%,结果表明8细胞期胚胎发育率在各组之间无显著差异;100 ng/ml组囊胚发育率明显高于对照组,有显著性差异（P＜0.05）。五、RNAi干涉IGF-ⅠR对胚胎发育的影响1.IGF-ⅠR siRNA的设计与干涉效果检测本研究首次把siRNA用于牛胚胎发育的研究。利用软件设计siRNA干涉序列,并对合成回来的序列进行干涉效果检测。对未成熟卵母细胞注射IGF-ⅠRsiRNA和对照siRNA,然后在加有成熟抑制剂的M199培养液中培养,分别于培养6小时和24小时后对IGF-ⅠR mRNA进行定量PCR检测。结果显示注射6小时和24小时后IGF-ⅠR mRNA表达量分别降为72%和54%。对受精卵注射IGF-ⅠR siRNA,于培养24小时后检测卵裂胚的mRNA和蛋白表达,发现均有所减少。结果表明,本实验所设计的IGF-ⅠsiRNA具有良好的干涉效果,可以用于IGF-Ⅰ基因敲减的研究。2.IGF-ⅠR siRNA注射对早期胚胎发育的影响注射IGF-ⅠR siRNA的受精卵经发育培养,于受精后第八天统计发育率和囊胚细胞数;未注射组、注射对照siRNA组、注射IGF-ⅠR siRNA组的8细胞期胚胎发育率、囊胚发育率分别为48.8%、46.7%、38.9%和35.4%、33.0%、23.3%;各组囊胚细胞数分别为:116、81、64。结果表明,各组在8细胞期胚胎发育率方面没有显著差异,但是在囊胚发育率方面注射IGF-ⅠR siRNA组明显低于两对照组,有显著差异（P＜0.05）;在囊胚细胞数方面,注射后的囊胚细胞数明显低于未注射组（P＜0.05）,注射对照siRNA组囊胚细胞数明显比注射IGF-ⅠsiRNA组囊胚细胞数多,具有显著差异（P＜0.05）。研究结果表明,在牛卵母细胞和早期胚胎中有IGF-Ⅱ和IGF-ⅠR、ⅡR mRNA和蛋白的存在,但是无法检测到IGF-ⅠmRNA。在成熟液和发育液中添加IGF-Ⅱ可以提高胚胎发育率,而且在成熟液中添加IGF-Ⅱ可以增加囊胚细胞数,但是对于凋亡细胞数没有影响。通过注射IGF-ⅠR siRNA发现,IGF-ⅠR siRNA显著降低了胚胎发育率和囊胚细胞数。
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标签：胰岛素样生长因子论文; 胚胎发育论文; 免疫细胞化学论文; 实时定量论文; 干涉论文;