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三疣梭子蟹卵巢发育期间卵黄蛋白原（Vg）、卵黄磷蛋白（Vn）及Vg-mRNA表达的变化研究

2020-12-24阅读(493)

三疣梭子蟹卵巢发育期间卵黄蛋白原（Vg）、卵黄磷蛋白（Vn）及Vg-mRNA表达的变化研究

论文摘要

三疣梭子蟹是我国海产重要经济蟹类之一,由于池塘养殖亲本通常存在卵巢发育不良和生殖性能差等缺点,故目前繁殖亲本主要来源野生.因此,研究和了解三疣梭子蟹的卵黄发生规律和调控机制显得十分迫切.鉴于此,本文首先分离和纯化了三疣梭子蟹卵黄磷蛋白（Vn）,在此基础上建立卵黄蛋白原Vg/Vn测定的酶联免疫吸附法（ELISA）,然后系统研究了三疣梭子蟹卵巢发育期间卵巢、肝胰腺和血淋巴中Vg/Vn的含量,最后测定了三疣梭子蟹不同卵巢发育时期卵巢和肝胰腺中的卵黄蛋白原基因（Vg-mRNA）的丰度,结果不仅可为深入了解三疣梭子蟹的卵黄发生机制提供基础资料,也可为三疣梭子蟹的卵巢发育调控和亲本质量评价提供依据。1.采用凝胶过滤层析法纯化了三疣梭子蟹成熟卵巢的卵黄磷蛋白（Vitellin, Vn）,采用变性凝胶电泳（SDS-PAGE）确定了Vn亚基数量和分子量,以纯化的Vn为抗原,制备了三疣梭子蟹Vn多克隆抗血清,纯化后得到Vn抗体,在此基础了比较和优化了三疣梭子蟹Vn测定的酶联免疫吸附法（ELISA）参数,建立了稳定的三疣梭子蟹Vn含量测定的ELISA方法.结果表明: （1） SDS-PAGE显示三疣梭子蟹成熟卵巢中的Vn含有分子量为100kDa、75kDa和66kDa的三个亚基, Western-blotting检测表明:（1）这三个亚基均具有较强的免疫特异性; （2）样品直接包被法比双抗体夹心法具有更高的线性相关性, Vn抗体最佳稀释倍数为1:90000,最佳包被时间为8小时,一抗和二抗反应时间分别为2小时和1小时,显色时间为20分钟; （3）该方法定性检测的灵敏度为14.9 ng/mL左右,标准曲线方程为y=0.0009x++0.3991 （R2=0.9861）,其中x和y分别代表Vn浓度和OD450值,工作范围为200-900ng/mL; （4）应用该方法测定三疣梭子蟹卵巢中Vn含量,结果表明批次内和批次间平均变异系数分别为3.59%和3.10%,重复性良好.2.卵黄蛋白是甲壳动物成熟卵巢和胚胎最重要的营养物质,他对于甲壳动物生殖起着极为重要的作用.本研究采用考马氏亮蓝法和酶联免疫吸附法（Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay, ELISA）系统测定了三疣梭子蟹卵巢发育期间卵巢、肝胰腺和血淋巴中的可溶性总蛋白和卵黄磷蛋白的含量（Vn/Vg）含量,并对Vn含量与卵巢发育的相关性进行了探讨.结果表明: （1）卵巢发育期间,卵巢指数（GSI）显著增长,肝胰腺指数（HSI）为先下降后上升再下降趋势,肝胰腺指数和卵巢指数并无显著相关性; （2）卵巢发育期间,卵巢中的可溶性总蛋白呈显著上升趋势,肝胰腺中的总蛋白为中间高两头低趋势,血淋巴中总蛋白为前期低,中后期高; （3）卵巢发育期间,卵巢中的Vn显著上升,最高值在Ⅴ期,高达256.93mg/g湿重,总可溶性蛋白中超过80%的为Vn;Ⅰ和Ⅱ期肝胰腺中检测不出Vg,此后开始显著上升,血淋巴中的Vn含量在Ⅱ-Ⅳ期显著上升,Ⅴ显著下降,仅为3.48μg/ml.以上结果暗示,三疣梭子蟹卵巢发育中后期卵黄蛋白主要来源于肝胰腺合成,然后通过血淋巴运输到卵巢中;卵巢发育成熟后,肝胰腺中VgmRNA丰度和血淋巴中的Vn含量大幅度下降,这说明成熟期的三疣梭子蟹的外源性卵黄蛋白合成较少.3.使用实时荧光定量PCR的方法,对不同发育时期的雌性三疣梭子蟹肝胰腺和卵巢组织中Vg-mRNA进行了测定,结果表明Vg-mRNA在卵巢和肝胰腺内均有表达,卵巢中表达量远低于肝胰腺。卵巢发育过程中,肝胰腺和卵巢中Vg-mRNA变化模式有所不同,肝胰腺中Vg-mRNA为先上升后下降趋势,最高值出现在四期;卵巢中Vg-mRNA相对表达量无明显规律性,三期早期和五期表达量相对较高,但是与四期卵巢并无显著差异。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 十足目甲壳动物卵黄蛋白原（Vg）和卵黄磷蛋白（Vn）合成及其调控机制的研究进展
  • 前言
  • 1. 甲壳动物Vg 的结构, 理化性质和合成位点
  • 1.1 甲壳动物 Vg 的结构, 理化性质
  • 1.2 甲壳动物Vg/Vn 合成位点
  • 2. Vg 含量的测定方法
  • 3. Vg 的合成内分泌和分子调控机制, 合成基因的序列比较等
  • 3.1 Vg 的合成内分泌机制
  • 3.2 Vg 合成的分子机制
  • 4.常见甲壳动物的不同卵巢发育阶段 Vg 含量及其 mRNA 丰度的变化
  • 参考文献
  • 第二章 三疣梭子蟹卵黄磷蛋白纯化及其ELISA 方法
  • 1. 材料与方法
  • 1.1 实验用蟹和解剖
  • 1.2 试剂配置
  • 1.3 卵黄磷蛋白分离和纯化
  • 1.4 卵黄磷蛋亚基数量和分子量确定
  • 1.5 抗体制备和免疫印迹
  • 1.6 样品直接包被法和抗体夹心法ELISA 比较
  • 1.7 ELISA 反应条件优化
  • 1.8 标准曲线制备
  • 1.9 验证性实验
  • 1.10 数据分析
  • 2. 结果与分析
  • 2.1 Vn 纯化和亚基数量
  • 2.2 样品直接包被法和抗体夹心法ELISA 效果
  • 2.3 ELISA 反应条件优化
  • 2.4 标准曲线
  • 2.5 验证性试验
  • 3. 讨论
  • 3.1 不同蟹类Vn 特性比较
  • 3.2 样品（抗原）直接包被法和抗体夹心法
  • 3.3 影响ELISA 测定的因素及标准曲线制作
  • 参考文献
  • 第三章 三疣梭子蟹卵巢发育期间组织中卵黄磷蛋白含量的变化
  • 1. 材料与方法
  • 1.1 实验用蟹和解剖
  • 1.2 卵黄磷蛋白和总蛋白含量测定
  • 1.3 数据分析
  • 2. 结果与分析
  • 2.1 卵巢指数和肝胰腺指数
  • 2.2 组织中可溶性蛋白含量的变化
  • 2.3 组织中Vn 和Vg 含量的变化
  • 3. 讨论
  • 3.1 蟹类卵黄合成位点
  • 3.2 卵巢发育期间组织中Vg/Vn 含量的变化原因和规律
  • 参考文献
  • 第四章 三疣梭子蟹不同发育时期卵黄蛋白原mRNA 表达分析
  • 1. 材料
  • 1.1 实验用蟹和解剖
  • 1.2 试剂
  • 1.3 主要仪器
  • 2. 方法
  • 2.1 抽提
  • 2.2 RNA 电泳
  • 2.3 引物设计
  • 2.4 cDNA 第一链的合成
  • 2.5 聚合酶链反应（PCR）
  • 2.6 电泳检测PCR 产物条带大小
  • 2.7 实时荧光定量PCR
  • 2.8 实时荧光定量PCR 数据处理
  • 3. 实验结果
  • 3.1 RNA 电泳检测
  • 3.2 聚合酶链反应（PCR）结果
  • 3.3 标准曲线
  • 3.4 卵巢和肝胰腺中VgmRNA 表达的变化
  • 4. 结论
  • 参考文献
  • 小结
  • 1. 本研究的主要结论
  • 2. 本研究的创新点
  • 3. 本研究的不足之处
  • 4 研究展望
  • 致谢

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